组织总抗氧化能力（tac）比色法（dpph）定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
组织总抗氧化能力（tac）比色法（dpph）定量检测试剂是一种旨在通过有机氮自由基染料dpph的参与，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种新鲜组织（动物、人体、植物、昆虫等）的总抗氧化能力检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；o2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；h2o2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；oh-）、过氧化基（peroxyl radical；roo-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；hoo）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitric oxide；no-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；onoo-）次氯酸（hypocorous acid；hocl）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（reactive oxygen species；ros）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；cer）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性和尿酸（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ros的损害。通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical；dpph），受到抗氧化剂的去自由基作用，呈现深紫色转化为黄色的变化，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪（515nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚trolox对照。
产品内容
清理液（reagent a） 250毫升
低渗液（reagent b） 25毫升
缓冲液（reagentc） 20毫升
染色液a（reagentd1） 1瓶
染色液b（reagentd2） 10毫升
标准液（reagente） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（reagent a）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于组织样品操作的容器
2毫升离心管：用于组织样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于组织裂解悬液存放的容器
4℃微型台式离心机：用于样品操作
超声仪：用于破碎组织细胞
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量200毫克
2．移入到一个液氮冻存管
3．即刻放进液氮罐过夜
4．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
5．放进一个15毫升锥形离心管
6．加入2毫升4℃预冷的清理液（reagent a）
7．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
8．转移到4℃预冷的2毫升离心管
9．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000rpm，例如eppendorf 5415）
10．小心抽去上清液
11．加入1毫升4℃预冷的清理液（reagent a），混匀
12．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000rpm，例如eppendorf 5415）
13．小心抽去上清液
14．重复实验步骤11至13二次
15．加入500微升低渗液（reagent b），混匀
16．置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
17．超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
18．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g（或10000rpm，例如eppendorf 5415）
19．移取上清液到新的4℃预冷的1.5毫升离心管
20．移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
21．使用清理液（reagent a）调整蛋白浓度为100微克/10微升
22．置于冰槽里待测
二、标准液准备
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2．分别加入50微升缓冲液（reagentc）到2至5号管
3．移取100微升标准液（reagente）到1号管，混匀
4．小心移取50微升1号管的标准液（reagente）到2号管，混匀
5．小心移取50微升2号管稀释的标准液（reagente）到3号管，混匀
6．小心移取50微升3号管稀释的标准液（reagente）到4号管，混匀
7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号
缓冲液（reagentc）
标准液（reagente）
测定体系
标准trolox浓度
1
0
100微升
80微摩尔/升
2
50微升
50微升
40微摩尔/升
3
50微升
50微升
20微摩尔/升
4
50微升
50微升
10微摩尔/升
5
50微升
0
0
三、样品测读
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取5毫升染色液b（reagent d2）到1瓶染色液a（reagent d1）里，混匀，置于暗室里，标记为染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。
1．准备1个96孔板，做好标记：空白对照孔、标准样品孔、待测样品孔
2．分别移取205微升缓冲液（reagentc）到96孔板里的每个孔里
3．分别加入25微升染色工作液
4．加入20微升缓冲液（reagentc）到空白对照孔
5．加入20微升上述配制的标准液（reagente）到相应标准样品孔里
6．加入20微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里
7．轻轻摇动96孔板，使其混匀
8．室温下孵育15分钟
9．即刻放进酶标仪里测读：515nm波长
10．分析结果：
1）构建标准曲线：纵座标（y轴）为吸光单位（od515nm）；横座标（x轴）为标准trolox浓度（微摩尔/升）
2）空白对照孔为最大吸光单位（od515nm）读数
3）标准样品孔和待测样品孔为实际吸光单位（od515nm）读数
4）根据标准曲线获得样品对应trolox浓度（微摩尔/升）
5）计算样品实际总抗氧化能力
【根据标准曲线获得样品对应trolox浓度（微摩尔/升）×0.25（体系容量：毫升）×样品稀释倍数】÷0.02（样品容量：毫升）=（微摩尔/升trolox等值）
6）根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）
【（空白对照孔吸光单位读数－实际吸光单位读书）÷空白对照孔吸光单位读数】×100％
7）ic50:50％抑制率所需的样品单位：trolox等值或样品蛋白量（毫克/毫升）或样品容量（微升）
x（所需样品单位）=（已知样品单位÷实际抑制百分率）×50％
注意事项
1．本产品为50次操作，包括标准品
2．本产品测试范围为10至100微摩尔trolox等值
3．操作时，须戴手套
4．样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
5．用户可以调整标准曲线区间
6．测试前，样品须新鲜收集
7．样品须清澈
8．空白对照孔的吸光读数应为1.0左右为佳
9．样品读数越低，抗氧化能力越高
10．可以使用比色皿检测
11．如果样品抗氧化剂浓度过高或过低，建议稀释或增加样品容量或浓度
12．建议待测样本的蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
13．如果测试样品很多，建议使用排枪移液
14．本公司提供系列抗氧化分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
关键词：台式离心机 酶标仪 离心机