pcr反应条件的把控
1. pcr反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度总量应比dntps的浓度高，常用1.5 mmol/l。
3. 底物浓度dntp以等摩尔浓度配制，20～200 umol/l。
4. taqdna聚合酶2.5u(100 ul）。
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/l。
6. 反应温度
（1）变性温度和时间95℃，30 s。
（2）退火温度和时间 低于引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
（4）tm值=4(g+c) +2(a+t)
7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定pcr扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，dna聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。