gb 31660.2-2019食品安全国家标准
水产品中辛基酚、壬基酚、双酚a、已烯雌酚、雌酮、17α-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇残留量的测定
气相色谱-质谱法
1范围
本标准规定了水产品中辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇残留量检测的制样和气相色谱-质谱测定方法。
本标准适用于鱼、虾，蟹、贝类、海参、鳖等水产品可食组织中辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇残留量的检测。
2规范性引用文件
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gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样中辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇残留经乙酸乙酯提取，凝胶透色谱及固相萃取净化，七氟丁酸酐衍生，气相色谱-质谱法测定，外标法定量。
4试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t6682规定的一级水。
4.1试剂
4.1.1乙酸乙酯（ch3cooc2h5）：色谱纯。
4.1.2丙酮（ch3cooch3）：色谱纯。
4.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯
4.1.4甲醇（ch3oh）：色谱纯。
4.1.5环己烷（c6h12）：色谱纯。
4.1.6七氟丁酸酐（c8f14o3）。
4.1.7碳酸钠（na2co3）。
4.2溶液制备
4.2 1碳酸钠溶液：称取碳酸钠10 g，用水溶解并稀释至100 ml，混匀。
4.2.2 50%环己烷乙酸乙酯溶液：环已烷与乙酸乙酯等体积混合。
4.2.3 50%甲醇溶液：甲醇与水等体积混合。
4.3标准品
辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇含量均≥98.0%，具体内容参见附录a。
4.4标准溶液制备
4.4. 1标准储备液：取辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇标准品各10mg，精密称定，于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为1mg/ml的标准储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
4.4.2混合标准工作液：分别精密量取标准储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为辛基酚50μg/l，壬基酚、双酚a 30μg/l，己烯雌酚50μg/l，雌酮、17a-乙炔雌二醇、17-雌二醇、雌三醇100μg/l的混合标准工作液。2℃~8℃避光保存，有效期1周。
4.5材料
4.5.1聚苯乙烯凝胶填料：bio-beads s-x3，200目~400目。
4.5.2hlb固相萃取柱：60mg/3ml，或相当者。
4.5.3凝胶净化柱：长25cm，内径2cm，具活塞玻璃层析柱。将50%环己烷乙酸乙酯溶液浸泡过夜的聚苯乙烯凝胶填料以湿法装入柱中，柱床高20 cm。柱床始终保持在50%环己烷乙酸乙酯溶液中。
5仪器和设备
5.1气相色谱质谱联用仪：配ei源。
5.2分析天平：感量0. 00001 g和0.01 g。
5.3均质机。
5.4离心机：4 000r/min。
5.5涡旋振荡器。
5.6氮吹仪。
5.7固相萃取装置。
5.8聚丙烯离心管：50 ml。
5.9具塞玻璃离心管：10 ml。
5.10梨形瓶：100 ml。
6试料的制备与保存
6. 1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质；
a）取均质后的供试样品，作为供试试料；
b）取均质后的空白样品，作为空白试料；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-18℃以下保存。
7测定步骤
7.1提取
取试料5 g（准确至±20 mg），于50 ml离心管中加碳酸钠溶液3 ml、乙酸乙酯20 ml，涡旋混匀，超声提取10 min，4000 r/min离心10 min，取上清液至100 ml梨形瓶中。残渣用乙酸乙酯10 ml重复提取一次，合并上清液，于40℃旋转蒸发至干，用50%环己烷乙酸乙酯溶液5 ml溶解残留物，备用。
7.2净化
7.2.1凝胶净化
将备用液转至凝胶净化柱上，用50%环己烷乙酸乙酯溶液110 ml淋洗，根据凝胶净化洗脱曲线确定收集淋洗液的体积，40℃旋转蒸干，残渣用甲醇1 ml溶解，加水9 ml稀释，备用。
凝胶净化柱洗脱曲线的绘制：将5 ml混合标准溶液上柱，用50%环己烷乙酸乙酯溶液淋洗，收集淋洗液，每10 ml收集一管，于40℃水浴中氮吹至干。按7.3的方法衍生，气相色谱-质谱法测定，根据淋洗体积与回收率的关系确定需要收集的淋洗液体积。
7.2.2固相萃取净化
固相萃取柱依次用甲醇5 ml、水5 ml活化，取备用液过柱，控制流速不超过2 ml/min，用50%甲醇水溶液10 ml淋洗，抽干，用甲醇10 ml洗脱，控制流速不超过2 ml/min。收集洗脱液于10 ml具塞玻璃离心管中，于40℃水浴中氮气吹干。
7.3衍生
于上述具塞玻璃离心管中加入七氟丁酸酐30μl、丙酮70μl，盖紧盖，涡旋混合30 s，于30℃恒温箱中衍生30 min，氮气吹干，精密加入正己烷0.5 ml，涡旋混合10 s，溶解残余物，供gc-ms分析。
7.4标准曲线的制备
取混合标准工作溶液50μl、100μl、200μl，500μl、1000μl于1.5 ml样品反应瓶中，40℃水浴中氮吹至干，按7.3方法衍生，制成辛基酚、己烯雌酚浓度均为5μg/l、10μg/l、25μg/l、50μg/l、100μg/l的梯度系列，壬基酚、双酚a浓度均为3μg/l、6μg/l、15μg/l、30μg/l、60μg/l的梯度系列，雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇浓度均为10μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l的梯度系列。分别取1μl进样，以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
7.5测定
7.5.1色谱参考条件
a）色谱柱：hp-5ms石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），或相当者；
b）载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 ml/min；
c）进样方式：无分流进样；
d）进样量：1μl；
e）进样口温度：250℃；
f）柱温：初始柱温120℃，保持2 min，以15℃/min升至250℃，再以5℃/min升至300℃，保持5 min。
7.5.2质谱参考条件
a）离子源：ei源；
b）离子源温度：230℃；
c）四极杆温度：150℃；
d）接口温度：280℃；
e）溶剂延迟：7 min；
f）选择离子监测（sim）：辛基酚、壬基酚、双酚a、己烯雌酚、雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇衍生物的监测离子见表1。
7.5.3测定法
7.5.3.1定性测定
在同样测试条件下，试样液中待测物的保留时间与标准工作液中待测物的保留时间偏差在±0.10min以内，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表2要求。
7.5.3.2定量测定
按7.5.1和7.5.2设定仪器条件，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量定量离子见表1。标准溶液衍生物的特征离子质量色谱图参见附录b。
7.6空白试验
除不加试料外，均按上述测定步骤进行。
8结果计算和表述
试料中待测药物残留量按式（1）计算。
式中：
x——试样中被测组分的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——试样溶液中被测组分的峰面积；
as——标准溶液中被测组分的峰面积；
v——试样溶液定容体积，单位为毫升（ml）。
m——试料质量，单位为克（g）。
计算结果需扣除空白值。测定结果用2次平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
9检测方法的灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法的检测限辛基酚、己烯雌酚分别为0.2μg/kg，壬基酚、双酚a分别为0.1μg/kg，雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇分别为0.3μg/kg；定量限：辛基酚、己烯雌酚分别为0. 5μg/kg，壬基酚、双酚a分别为0.3μg/kg，雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇分别为1.0μg/kg。
9.2准确度
辛基酚、己烯雌酚在0. 5μg/kg~10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70%~110%；壬基酚、双酚a在0.3μg/kg~6μg/kg添加浓度范围内，回收率为70%~110%；雌酮、17ɑ-乙炔雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇在1.0μg/kg~20μg/kg添加浓度范围内，回收率为70%~110%。
9.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。