基本的显微镜技术之一是“宽视野显微镜”。从根本上讲，这是将感兴趣的整个标本暴露在光源下并由观察者或照相机（也可以连接至计算机监视器）查看所得图像的任何技术。
本文将着手解释宽视野（wf）和共聚焦显微镜之间的差异，特别是着眼于两个系统之间的成像和照明之间的差异。还将讨论wf成像的显微镜配置，着眼于所涉及的光路以及散焦光的问题。下面将介绍更高级的wf技术，例如wf超分辨率。
宽视野和共聚焦显微镜的基本比较在wf显微镜中，显微镜载物台上的整个标本都将暴露在光源下（图1）。宽视场显微镜的基本形式是“明场显微镜”，其中整个标本通过白光从上方（倒置配置）或下方（在标准立式显微镜中）照射。
在共聚焦激光扫描显微镜中，激发荧光染料和蛋白质的光源来自激光单元，而激光单元是整个共聚焦系统*的一部分。共聚焦显微镜的主要优点是可以选择用户定义的感兴趣区域，而无需将整个样本暴露在荧光光源下。另外，共聚焦显微镜可用于获得通过标本的光学切片，该标本的优点是可以排除许多散焦或背景荧光。
标准wf显微镜比通常由白色和荧光光源，显微镜和照相机（带或不带连接的计算机）组成的共聚焦显微镜要复杂。在共聚焦系统中，显微镜本身只是配置的一部分，包括激光单元，共聚焦“扫描头”（包含用于排除聚焦光的针孔和用于从标本中收集光子的光电倍增管）以及用于控制多个参数的计算机在系统以及图像处理中。
图1：共焦与宽视野照明。共聚焦：来自光源（ls）的光通过针孔聚焦以进行照明（pi），然后进入样品（s），从而产生相对较小的体积。宽视野：整个样品体积都暴露在光线下。
在宽视野和共聚焦显微镜下比较光源在常规的激光扫描共聚焦显微镜中，可能需要大约五个不同的激光源来覆盖常用荧光团的激发波长。例如，常用的激光器是氩离子激光器，其可以产生由滤波器选择的一系列激发波长。氩离子激光器覆盖激发光谱的绿色波长，并用于激发诸如fitc（异硫氰酸荧光素）之类的荧光团。激发光谱的黄色到红色波长被氦氖激光器覆盖，其范围从大约543到632 nm。该光谱用于激发诸如德克萨斯红和若丹明的荧光团。
在将发光二极管（led）用作wf显微镜的荧光光源之前，激发光的主要来源是气体弧光灯，并且这些气体仍在当今得到广泛使用。在wf显微镜中常见的两个弧光灯是汞弧光灯（也称为“汞燃烧器”或“汞蒸气灯”）和氙弧光灯。汞弧光灯提供了许多可见光谱范围内的激发波长（见图2），但是，这种照明并不均匀，并且主峰在近紫外（uv）波长内（313、334、365、405） （436纳米），在光谱的绿色/黄色部分有另外两个峰，分别位于546和579 nm。
图2：在某些光源的帮助下实现了显微镜照明。激光，气体弧形灯和led都有其优缺点，并且在整个可见光谱范围内的发射方面可能存在明显差异。
与汞灯相比，氙灯在大多数可见光谱范围内提供激发波长，但是在此范围内的峰值达不到汞燃烧器的强度。尽管与汞燃烧器相比，氙弧灯没有延伸到光谱的紫外线部分，但它们的激发范围进一步移向了红外波长。
尽管这些灯为荧光显微镜提供了非常强烈的光源，它们并非没有固有的问题。这些灯泡的使用寿命受到汞燃烧器的持续时间（通常为200至300小时）和氙灯（持续时间在400至600小时之间）的限制。由于它们的使用寿命受到限制，因此应在显微镜下仔细记录使用的小时数（尽管某些系统具有内置的使用小时数记录器）。如果在建议的使用寿命范围内使用了气体弧光灯，则存在爆炸的危险。此外，如果定期打开/关闭灯，则可能会大大缩短灯泡的使用寿命，因此需要考虑到这一点。用过的弧光灯需要仔细处理，并应根据实验室或研究所的规定进行处理。
图3：将汞灯从灯箱中拆卸下来（背景）以进行更换。
尽管上面突出了一些缺点，但是由于产生的光强度，汞灯仍被认为是wf荧光显微镜的基本光源。
新一代用于显微镜的led光源不仅提供完整的激发波长光谱（约365至770 nm），而且强度可与弧光灯媲美。弧光灯的主要优点是led光源的使用寿命长达50,000小时，而无需预热或冷却时间。这也节省了时间，因为led单元在初安装时仅需要一次对齐调整。后，废热是弧光灯的一个问题，因此它们被安装在显微镜旁边的特殊外壳中。由于大多数带led的电输入都转换为光，因此它们几乎不产生任何废热。
在宽视野和共聚焦显微镜下比较图像捕获如上所述，共聚焦扫描头包含一组光电倍增管（pmt），用于从样品中收集光子。通常，共焦扫描头将包含至少三个负责收集红，绿和蓝光的pmt，但是其他pmt通常用于收集透射或反射的光。pmt本身不是照相机，而是由真空管组成，该真空管的一端具有光子进入窗口，而在管体中具有一个电子倍增组件（图4）。在终组装并显示图像之前，将收集的光子数量转换为电信号。许多共聚焦系统还配备了类似于wf显微镜的相机。
基于光电二极管的更传统的摄像头可促进wf显微镜中的图像捕获（参见图4）。数码显微镜相机包含半导体检测器，见的传感器是电荷耦合器件（ccd），互补金属氧化物半导体（cmos）和scmos（科学cmos）。ccd和cmos相机之间有许多相似之处，尽管它们以不同的方式处理图像信号，从而可能影响相机的捕获时间以及诸如信噪比之类的因素。基于ccd的相机的帧速率可能比cmos慢10倍传感器由于其功能的固有性质。因此，摄像机的选择取决于目标样品的动态特性。
图4：在共聚焦显微镜下，光子由光电倍增管收集（左）。它们由真空管组成，该真空管的一端具有光子进入窗口，另一端具有用于放大的电子倍增组件。显微相机芯片由数百万个光电二极管组成（右）。感光二极管的主要复合材料是光电硅。传入的光子能量用于激发硅中的电子，这些电子又被收集在存储井中，然后转移到放大器中。
宽视野显微镜的结构如图5所示，宽视野显微镜是正置的，其中载玻片从下面照亮，或者是倒置的，其中载玻片从上面照亮，如图5所示。这种配置会对可以研究的样本产生影响。正置显微镜通常用于固定样品的应用，并固定在载玻片上。倒置显微镜已经被发明来观察活细胞。它们通常在液体溶液中生长。只有物镜在样品下方且聚光镜在样品上方的配置才能确保物镜与样品足够接近。
图5：立式显微镜的特征是样品上方的物镜和样品下方的聚光镜（左）。在倒置显微镜上，该设置被翻转（右）。
落射荧光是用于描述荧光显微镜的术语，其中同一透镜（物镜）用于照射和收集样品发出的光。光从光源传播，穿过滤光镜组，通过双色镜，并且较短波长的激发光通过物镜反射到样品上。样本发出的较长波长的光向后穿过物镜，并穿过双色镜，然后沿目镜成像和/或由相机收集。
透照技术包括诸如相差和微分干涉衬比（dic）显微镜的对比方法。但是，透射荧光显微镜是既不为人所知也不为人所使用的方法。该方法取消了使用双色透镜，而是使激发光穿过聚光镜和样品，并且物镜收集到发射光。然而，该技术存在许多初始问题，例如背景水平高以及难以使聚光镜和物镜光学匹配。克服这些问题的进展导致跨荧光成像被用于诸如体内成像和牙科研究等领域。
宽视野显微镜中的对比方法显微镜的对比方法（包括微分干涉对比（dic）和相差显微镜）可以与wf荧光显微镜结合使用（图6）。
结合wf荧光显微镜和对比技术可以提供有价值的信息和可行性和形态的图像。共聚焦系统具有同时捕获对比度和荧光图像的能力，可以使用图像分析软件将其覆盖。但是，在wf荧光显微镜中，诸如此类的同时成像需要使用裂像相机适配器或使用两个单独的相机，一个用于对比度，一个用于荧光。更通常的是，照相机将捕获荧光图像，然后将光学元件更改为对比照明，然后同一台照相机将捕获对比图像。然后可以使用图像分析软件来组合这些图像。
图6：dic（左），相差（中）和荧光显微镜（右）中的神经元细胞培养。
宽视野显微镜的分辨率显微镜的分辨率仅仅是区分样本中细节的能力。它是样本的两个不同点仍可以视为独立实体的小距离。
与所有常规光学显微镜系统（包括共焦）一样，分辨率由数值孔径（na）和光的波长确定。在光学显微镜下，分辨率的极限约为200 nm。在具有na光学器件的*对准的显微镜系统中，分辨率的极限大约是用于对样本成像（或激发荧光团）的光的波长的一半。在将wf与共聚焦显微镜进行比较时，两种方法的分离度的理论极限都相似。
但是，wf显微镜实现的实际分辨率会因背景荧光而加剧。如上面突出显示的那样，整个样本在wf显微镜下照明，因此焦平面上方和下方的区域也将发出荧光，并被照相机捕获并被观察者看到。这样，来自荧光团的发射波长可以被该背景荧光稍微掩盖，从而导致信噪比的总体降低以及随后可实现的分辨率和对比度的降低。
在共焦系统中，针孔（在扫描头内）用于阻止任何散焦光到达pmt检测器。尽管这具有通过阻止背景和自发荧光来产生清晰聚焦图像的优点，但是某些失焦光子可能源自焦平面。这意味着某些信息可能会由于针孔而丢失。在共焦系统上产生的清晰图像与使用wf显微镜无意间收集散焦光之间存在平衡。但是，使用称为“反卷积”的采集后过程可以解决模糊和聚焦问题（图7）。该计算过程可以将光子重新分配到其原点。
图7：草履虫规格的宽视野荧光显微镜。去卷积之前（左）和之后（右）。
扩展领域：wf frap和超分辨率技术的简要介绍光漂白后的荧光恢复（frap）是一种用于检查一段时间内分子迁移率的技术。该技术初用于研究细胞膜中脂质分子的动力学和流动性，但也可以用于研究细胞器或细胞质中的蛋白质。在frap实验中，将荧光探针与目标分子共价连接，或者将目标蛋白质改造为表达荧光团，例如绿色荧光蛋白（gfp）。
一旦确定了目标荧光团的位置，就故意（且不可逆地）对细胞内的目标区域进行光漂白，以消除所有荧光。随着时间的流逝，随着更多标记的目标蛋白以被动方式（通过扩散）或主动方式（通过运输）进入该区域，漂白区域将再次逐渐发荧光。这样的实验可以在确定蛋白质在细胞环境中的实时运动和特性方面产生有用的结果（图8）。
图8：frap实验可以深入了解分子动力学。限定范围的荧光分子可以用激光不可逆地漂白。随后的重新种群揭示了有关分子扩散和运输特性的细节。
尽管以前使用共聚焦显微镜进行了frap实验，但如今也有wf解决方案。与传统的基于共焦的frap实验相比，wf frap设备可以使用的相机提供更高的成像速度，还可以保护感兴趣的细胞和区域免受共焦系统造成的过度光应力。
超分辨率显微技术是那些可以成像超过200 nm分辨率极限的技术。近年来已经开发了许多超分辨率技术，其中包括：
·单分子定位技术，其中随时间收集少量荧光团信号以建立终图像。顾名思义，如果实验条件允许，可以捕获和成像单个分子。
·结构照明显微镜（sim）。在此技术中，在wf光的相位和振幅中创建了图案。被成像的样品还将产生相似的图案，并且所产生的和基于样品的图案之间的干扰被用于构建细胞内结构。
·受激发射耗竭（sted）显微镜。这种共聚焦技术需要两个激光器-一个用于激发荧光团，另一个为圆形激光束以“消耗”来自相同荧光团的发射，从而导致较小的图像捕获区域。
用wf显微镜可实现的一种单分子定位技术被称为直接随机光学重建显微镜（dstorm）或也被称为基态耗竭，然后是单个分子返回显微镜（gsdim）。
gsdim/dstorm利用激光和光开关荧光探针关闭和打开，以随着时间的推移建立图像。大多数荧光探针被诱导为“暗态”能级，在该能级下它们不能发射光子。这样只剩下单个和分离良好的荧光团，可以精确定位纳米。