通过流式细胞术进行 pbmc（外周血单核细胞）分析可广泛应用于研究和临床研究，包括 hiv 研究、癌症免疫治疗和基于细胞因子的免疫反应的基础研究。pbmcs通常通过密度梯度离心或磁珠分离从外周血、骨髓和脐带中提取。这些方法旨在将白细胞与红细胞 (rbc) 等其他细胞成分分离。
流式细胞术的一个常见应用是 pbmc 免疫表型分析。该技术测量被称为“分化簇”(cd) 标记的细胞表面分子的表达，以识别、区分和表征 pbmc 亚群。除了 cd 标记表达之外，计数和细胞大小的精确监测对于该分析也至关重要。其中一个例子是嵌合抗原受体 t (car-t) 细胞癌症免疫治疗领域。
为了表征 pbmc 上的 cd 标记，将针对 cd 标记的抗体与藻红蛋白 (pe) 等荧光团缀合。然后使用流式细胞仪测量荧光强度，以量化 cd 标记表达水平并区分 pbmc 亚群。本应用说明演示了用于表征 pbmc 上 cd 标记的单荧光团和双荧光团 pbmc 染色技术。
cd45 抗体和小鼠 igg 缀合物的制备材料：·1.buccutite™ 快速 pe 抗体标记试剂盒（货号 1310）
注意：试剂盒足以进行 2 次标记反应，每个反应 100 µg 抗体
·2.buccutite™ 快速 apc 抗体标记试剂盒（货号 1311）
注意：试剂盒足以进行 2 次标记反应，每个反应 100 µg 抗体
·3.1x pbs 缓冲液 (ph 7.2 – 7.4)
·4.4 个 2 ml 洗涤管
·5.4 个 1.5 ml 收集管
·6.离心机
所有 cd45 抗体和小鼠 igg 缀合物均使用以下应用说明制备：
·buccutite™ 快速藻胆蛋白抗体偶联
cd45 抗体和小鼠 igg 缀合物的浓度：使用 buccutite™ 快速藻胆蛋白抗体偶联应用说明和 buccutite™ 快速抗体标记试剂盒（货号 1310 和 1311）制备的 cd45 和小鼠 igg 偶联物的浓度如下：
pbmc的制备
冷冻保存的pbmc解冻并制备如下：
材料：
1.人类pbmc（冷冻保存，1000万个细胞/瓶）
2.血细胞培养基
3.胎牛血清
4.15ml锥形管
5.离心机
6.吸管
制备方法
1.收到冷冻的 pbmc 后，立即解冻细胞并开始培养，以保持最高的细胞活力。
2.要解冻细胞，请将小瓶放入 37°c 水中，轻轻搅拌约 1 分钟。
a.注意：将盖子远离水以尽量减少污染风险。
3.将细胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 ml 新鲜血细胞培养基的 15 ml 锥形管中。
a.注意：总体积 = 10.1 ml（100 µl pbmc + 9 ml 新鲜血细胞培养基 + 1 ml 胎牛血清）
4.在室温下以 1,000 rpm (~220g) 离心 5 分钟。
5.取出上清液，细胞即可使用。
pbmc 的单荧光团和双荧光团染色：前两节中制备的缀合物和 pbmc 用于以下细胞表面免疫标记方案。
材料：·1.pbmc
·2.hhbs 缓冲液（ 货号 20011）
·3.测定缓冲液（含 1% bsa 的 hhbs 缓冲液）
·4.台盼蓝钠盐*超纯级*（ 货号 2452）
·5.trustain fcx™cd45 – pe 结合物
·6.cd45 – apc 缀合物
·7.cd4 – fitc 缀合物
·8.cd3 – apc 缀合物
·9.小鼠 igg – pe 缀合物
·10.小鼠 igg – apc 缀合物
·11.novocyte 3000 流式细胞仪
pbmc 染色：1.在免疫标记之前，使用台盼蓝染料排除测试（2452）确定 pbmc 活力，每个样品使用 100 万个细胞。
2.用 hhbs 缓冲液（ 20011）通过离心机以 1000 rpm 洗涤 pbmc 2 次，每次洗涤 5 分钟。
3.为了阻断非特异性 fc 介导的相互作用，将 pbmc 重悬于含有 1% bsa 溶液的 hhbs 缓冲液和 human trustain fcx™5 µl/100 µl 检测缓冲液中，并在室温10分钟。
4.对于单荧光团 pbmc 染色，将 pbmc 与终浓度 0.1 µg 的 cd45-pe、cd45-apc、小鼠 igg-pe 或小鼠 igg-apc 在冰上避光孵育 20 分钟。
5.对于双荧光团 pbmc 染色，将 pbmc 与 cd45-pe 和 cd4-fitc 以及 cd45-pe 和 cd3-apc 共孵育。所有四种染料的终浓度均为 0.5 µg，在冰上避光保存 20 分钟。
6.用 assay buffer 清洗 pbmc 两次，然后将 pbmc 重悬于 assay buffer 中。
7.在流式细胞仪上进行分析。
使用 buccutite™ 缀合技术生成的缀合物可提供高质量的产量。这些缀合物在 pbmc 上进行了测试，并且可以灵活地与其他缀合物组合进行多色染色，以检测 pbmc 中的 cd 标记。
使用 cd45-pe、cd45-apc、cd4-fitc 和 cd3-apc 使用单荧光团和双荧光团对 pbmc 进行流式细胞术分析。密度图（最左边）用于从其他细胞群中排除淋巴细胞。直方图（右上）和密度图（右下）分别用于单次和多次荧光团染色。数据记录在 acea biosciences 的 novocyte 3000 流式细胞仪上，并使用 novoexpress 1.2.5 版进行分析。
关键词：流式细胞仪 离心机