wb实验中蛋白质的样品制备和蛋白质定量，你了解多少？
南京信帆生物提供 western blot实验代测服务！
western blot实验很常规，但是对于初学者来说蛋白质样品的制备和定量是非常关键的，但是你又了解多少呢？让我们跟着南京信帆生物的技术来揭开它神秘的面纱，让我们都清楚的了解和掌握它吧！
一、蛋白质的样品制备：
由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是western blotting的*步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:
> 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的大溶解性和可重复性。
> 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
> 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
> 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中*保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
> 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量
如果要定量的话，一般选择bca或者bradford方法，bca要求检测波长为562nm，bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入bca工作液或考马g250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。
网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。
上样总体积一般不超过15ul，加样孔的大限度可加20ul样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。也可以使用pcr仪95°加热5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。
通过上面的介绍，是不是对于wb实验中蛋白质的样品制备和蛋白质定量，你有了更深一步的了解呢？希望在接下来的实验中，大家都可以一切顺利，做出漂亮的实验结果和实验图片！
wb实验中蛋白质的样品制备和蛋白质定量，你了解多少？