羧肽酶 b (ec 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 c-末端碱性氨基酸（赖氨酸、*、*）的水解；又称为肽酰-l-赖氨酸（l-*）水解酶；精蛋白酶。分子量为 35kd，等电点为 6.0，zui适 ph 为 7-9。羧肽酶 b 是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。
而在抗体碱性峰的检测中，没有*统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性质密切相关。
可以选择的羧肽酶 b 有两种，一种是动物胰腺提取的羧肽酶 b，一种是基因工程的重组羧肽酶 b，前者由于胰腺中含有各种蛋白酶，如*、*等，常常不能*去除，在酶切时会有非特异的酶切杂峰出现，影响结果判断。后者为基因工程生产的，成分单一，无杂酶，比活高，应用上更有优势。
羧肽酶 b 的结构
天然存在的羧肽酶 b 是由前羧肽酶原 b（preprocarboxypeptidase b，preprocpb）经酶解产生，后者 n-末端包含 108 个氨基酸（其中 13 个氨基酸为信号肽序列，95 个氨基酸组成前导肽部分）的多肽片段与 cpb 相连。前羧肽酶原 b 在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得到无酶活性的羧肽酶原 b（procarboxypeptiedase b, procpb）并从细胞中分泌出来，zui终在小肠中经*在 arg-95 处酶解，成为具蛋白酶活性的 cpb。procpb 的分子量为 46kd，由 401 个氨基酸组成；cpb 分子量为 35kd，由 306 个氨基酸组成（如图 1）。在cpb 中，前体的活化主要依赖*在 arg95 位的切割，半球形前导肽被切割后，它既不会抑制酶体，也不再与之结合，这使得酶体能迅速发挥功能，并对前导肽 c-端的 arg 进行切割。
图 1 羧肽酶原 b 的三维结构及其激活部位示意图
（上面暗红色部分代表前肽，下面蓝色部分代表羧肽酶 b，箭头所指为*酶切激活位点）羧肽酶 b 的性质取重组羧肽酶 b 冻干粉，纯度见图 2。研究了重组羧肽酶 b 的zui适 ph，zui适温度，ph 稳定性及温度稳定性，对于 cpb 的使用起到指导作用。同时做了溶液的反复冻融稳定性，对于 cpb 酶液的储存和使用起到指导作用。
图 2 纯化后重组羧肽酶 b 的电泳分析
1、羧肽酶 b 的 ph 稳定性
将纯的重组羧肽酶 b 用纯水溶解为 10 mg/ml，之后用以下缓冲液稀释使酶液的终浓度为 1 mg/ml，ph 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0， 25℃ 孵育 12 h 后测活。结果见图 3（左）。
2、羧肽酶 b 的zui适 ph
测定 rcpb 纯酶液浓度为 1 mg/ml, 在不同 ph 条件下的催化速率，底物浓度为 0.1 mm/l，ph 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，ph3.0-5.0 用 50 mmnaac-hac 缓冲液配制，ph6.0-7.0 用 50 mmkpb 磷酸盐缓冲液配制，ph7.5-8.5 用 50 mm tris-hcl 缓冲液配制，ph9.0-12.0用 50 mm gly-naoh 缓冲液配制。结果见图 3（右）。
图 3 rcpb 酶液的 ph 稳定性（左）和zui适反应 ph（右）cpb 在 ph7.0-9.0 缓冲液中稳定，25℃ 孵育 12 h 无活性损失；zui适 ph 表明，在 ph7.6 活性zui大，在 ph7.5-ph8.5 活性均可以。在 ph≤7 和 ph≥10 时，基本无活性。
3、羧肽酶 b 的温度稳定性
将 rcpb 酶液配成浓度为 1 mg/ml，置于 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 条件下，每个温度三个平行，时间定为 15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、20 h 分别取样测定其活性，以初始时酶活定为 100%，以残余酶活百分比表示测定结果。
4、羧肽酶 b 的zui适催化温度
在不同温度下恒温水浴测活底物，使底物的温度分别为 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，取适量 rcpb 纯酶液，测定活力。以 254nm 吸光值 od254 为纵坐标，时间为横坐标，结果表示见图 4（右）。
图 4 rcpb 酶液的温度稳定性（左）和zui适催化温度（右）cpb 在 40℃ 以下保温 10 h，均活性稳定。zui适催化温度显示，在 3 min 内，40℃以下均可保持良好的线性，其中，以 25℃ 为*。
5、羧肽酶 b 酶液的反复冻融稳定性
将 rcpb 酶液反复冻融，测定每次冻融后的酶活，计算活力保留率，得到同一管 rcpb 反复冻融 10 次后的活力稳定性（如图 5）。
图 5 rcpb 酶液的反复冻融稳定性
结果表明重组羧肽酶 b 反复冻融稳定性好。经过 10 次的反复冻融，几无活性损失。
抗体碱性峰检测
羧肽酶 b 的准备：用 1x pbs ph7.5, 溶解羧肽酶 b 至 1 g/l，分装后-20℃ 保存。
抗体：纯化后的单抗样品超滤至磷酸缓冲液（ph=7.5）中（1~2 g/l）。
酶用量：按样品：酶= 20:1-100:1，此处用量为 100:1。
孵育温度及时间：37℃ 反应 30 分钟。
检测：直接进样 hplc 检测。
结果见图 6。
图 6 抗体经 cpb 处理和未处理的图谱比较
图 7 rituimab 羧肽酶 b 处理前后比较图（摘自 rituximab 的 usp 验证报告）在 rituximab 的 usp 验证报告中，规定了酸、碱性变体的含量。规定 rituximab的酸性变体 nmt 12.0% ，碱性变体 nmt 10.0%。鉴定方法为 cpb 处理前后的hplc 比较。