gb 31658.17-2021食品安全国家标准
动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件系首ci发布。
1范围
本文件规定了动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于牛、羊、猪和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织中四环素类（四环素、金霉素、土霉素、多西环素）、磺胺类（乙酰磺胺、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、苯甲酰磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、酞磺胺噻唑）和喹诺酮类（诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、、氟甲喹）药物残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不ke少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的本语和定义。
4原理
试样中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物，用mcllvaine na2edta缓冲液提取，亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯、水为符合cb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5.1.3乙酸乙酯（c4h8o2）：色谱纯。
5.1.4甲酸（hcooh）：色谱纯。
5. 1.5乙二胺四乙酸二钠·二水（c10h14n2na2o8•2h2o）。
5.1.6浓氨水（nh3h2o）。
5.1.7磷酸氢二钠•十二水（na2hpo4•12h2o）。
5.1.8磷酸二氢钠•二水（nah2po4•2h2o）。
5.1.9柠檬酸•一水（c6h8o7•h2o）。
5.1.10氢氧化钠（naoh）。
5.2溶液配制
5.2.1 0.05 mol/l磷酸二氢钠溶液：取磷酸二氢钠•二水7.8 g，用水溶解并稀释至1 000 ml。
5.2.2 0.05 mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠•十二水17.9 g，用水溶解并稀释至1 000 ml。
5.2.3磷酸盐缓冲液：取0.05mol/l磷酸二氢钠溶液190ml，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液稀释至1 000 ml。
5.2.4 1mol/l氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4 g，用水溶解并稀释至100 ml。
5.2.5 0.03 mol/l氢氧化钠溶液：取1 mol/l氢氧化钠溶液3 ml，用水稀释至100 ml。
5. 2.6 mcllvaine na2edta缓冲液：取柠檬酸•一水12.9g、磷酸氢二钠•十二水10.9 g、乙二胺四乙酸二钠•二水39.2 g，加水900 ml，用1 mol/l的氢氧化钠溶液调ph至5. 0±0.2，用水稀释至1 000 ml。
5.2.7洗脱液：取甲醇150 ml，加乙酸乙酯150 ml、浓氨水6 ml，混匀。
5.2.8复溶液：取水40ml，加甲醇5ml、乙腈5ml、甲酸0.05ml，混匀。
5.3标准品
5.3.1四环素类：四环素、金霉素、土霉素、多西环素含量均≥95.0%。具体见附录a。
5.3.2磺胺类：乙酰磺胺、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲噻二唑、苯甲酰磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、酞磺胺噻唑含量均≥95.0%。具体见附录a。
5.3.3喹诺酮类：诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹含量均≥95.0%。具体见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（1 mg/ml）：取标准品各适量（相当于各活性成分约10 mg），精密称定，于10 ml容量瓶中，四环素类、磺胺类药物加甲醇溶解并稀释至刻度；喹诺酮类药物加0.03mol/l氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，配制成浓度均为1 mg/ml的标准储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准工作液（10μg/ml）：分别取1 mg/ ml的标准储备液各0.1 ml，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期1个月。
5.4.3混合标准工作液（1μg/ml）：精密量取10μg/ml的混合标准工作液1 ml，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期1个月。
5.4.4混合标准工作液（0.1μg/ml）：精密量取10μg/ml的混合标准工作液0.1 ml，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为0.1μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期1个月。
5.5材料
5.5.1亲水亲脂平衡型固相萃取柱：200mg/6ml，或相当者。
5.5.2微孔尼龙滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3高速冷冻离心机：-2℃、14 000 r/min。
6.4组织匀浆机。
6.5涡旋混合器。
6.6固相萃取装置。
6.7氮吹仪。
6. 8超声波清洗仪。
7试料的制备与保存
7.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试料；.
b）取均质后的空白样品，作为空白试料；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
7.2试料的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
称取试料1 g（准确至±0.01 g），加mcllvaine na2edfa缓冲波8 ml，涡旋1 min，超声20min，-2℃、10000r/min离心5 min，收集上清液。残渣中加磷酸盐缓冲液8ml，重复提取1次，合并2次提取液，混匀，备用。
8.2净化
固相萃取柱依次用甲醇5ml和水5ml活化，取备用液过柱，依次用水5ml和20%甲醇水溶液5 ml淋洗，抽干，用洗脱液10ml洗脱。收集洗脱液，45℃水浴氮气吹干。加入复溶液1.0 ml，涡旋1 min溶解残余物，14000r/min离心5mm，微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
精密量取混合标准工作液适量，分别加入6份经提取和净化的空白试样残渣中，45℃水浴氮气吹干，加入复溶液1.0ml涡旋溶解残余物，配制成浓度为2μg/l、10μg/l、50μg/l、100μg/l、250μg/l和500μg/l的基质匹配系列混合标准溶液，微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4测定
8.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18：（50mm×2.1mm，1.7μm），或相当者；
b）柱温：35℃；
c）进样量：10μl；
d）流速：0.3 ml/min；
e）流动相：a为0. 1%甲酸水溶液b为甲醇：乙腈（2：8，含0.1%甲酸，体积比）溶液，梯度洗脱条件见表1。
8. 4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）离子源温度：100℃；
e）雾化温度：450℃；
f）电离电压：3.0 kv；
g）锥孔气流速：30 l/h；
h）雾化气流速：1000l/h；
i）定性离子对、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量见表2。
8.4.3定性测定
在同样测试条件下，试样溶液中四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物的保留时间与基质匹配标准溶液中相应四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物的保留时间，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.4.4定量测定
按8.4.1和8.4.2设定仪器条件，以基质匹配标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，基质匹配标准溶液及试样溶液中的目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准溶液特征离子质量色谱图见附录b。
8.5空白试验
取空白试料，采用完quan相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中四环素类磺胺类喹诺酮类药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——基质匹配标准溶液中四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
a——试样溶波中四环素类、磺胺类、喹诺酮类药物的色谱峰面积；
as——基质匹配标准溶液中四环素类，磺胺类、喹诺酮类药物的色谱峰面积；
v——试样最终定容体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——供试试样质量的数值、单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法的检测限为2μg/kg，定小限为10μg/kg。
10.2准确度
本方法在10μg/kg~500μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~110%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。