细菌糖类总量硫酸-苯酚比色法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细菌糖类总量硫酸-苯酚比色法定量检测试剂是一种旨在通过硫酸处理后，水解产生单糖，与苯酚反应，生成黄色产物，即采用比色法测算糖类总量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞样品中糖类总量的检测。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。
技术背景
糖类（saccharide），又称为碳水化合物（carbohydrate），其分成四类：单糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖类构成辅酶和核酸，以及细胞结构的重要元素，在能量储存、免疫功能、授精、预防病理变化、血液凝结、发育等方面具有重要作用。使用浓硫酸，将复杂性多糖水解成单糖，脱水产生反应性中间产物，与苯酚反应，生成黄色产物，在分光光度仪（492nm 波长）下出现吸光峰值的变化，来定量测定样品中糖类量的总含量。
产品内容
稀释液（reagent a） 5毫升
反应液（reagent b） 5毫升
酸性液（reagent c） 25毫升
标准液（reagent d） 500微升
裂解液（reagent e） 10毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里；酸性液（reagent c）具有腐蚀性，注意操作安全；反应液（reagent b）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器
干式恒温仪或恒温水槽：用于反应孵育
超声仪：用于裂解细菌细胞
比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220rpm
2．直至od600＝0.4至0.8，即1至2 x 107细胞/毫升
3．置于冰槽里5分钟
4．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
5．小心抽去上清液
6．加入500微升裂解液（reagent e），充分混匀
7．转移到预冷的1.5毫升离心管
8．强力涡旋震荡15秒
9．置于超声仪下：200瓦，50%功率，10秒一次，重复3次
10．冰槽里静置15分钟
11．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
12．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
13．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
14．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、标准样品配制
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2．分别加入200微升稀释液（reagent a）到每个离心管
3．移取200微升标准液（reagent d）到1号管，混匀
4．小心移取200微升1号管稀释的标准液（reagent d）到2号管，混匀
5．小心移取200微升2号管稀释的标准液（reagent d）到3号管，混匀
6．小心移取200微升3号管稀释的标准液（reagent d）到4号管，混匀
7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号
标准液（reagent d）
稀释液（reagent a）
测定体系中
标准麦芽糖含量
1
200微升
200微升
50微克
2
200微升1号管
200微升
25微克
3
200微升2号管
200微升
12.5微克
4
200微升3号管
200微升
6.125微克
5
——
200微升
0
三、样品测定
1．设定好分光光度仪：波长492nm，并置零
2．分别移取200微升反应液（reagent b）到1.5毫升离心管
3．分别加入200微升上述制备的标准样品或待测样品，混匀
4．分别加入1毫升酸性液（reagent c），混匀
5．在80℃干式恒温仪孵育30分钟（注意：如果复杂多糖无法充分水解，建议使用煮沸5至30分钟处理）
6．室温下冷却10分钟，避免光照
7．转移到新的比色皿
8．即刻放进分光光度仪检测（492nm波长）：获得吸光读数
9．构建标准曲线：纵座标（y轴）为吸光读数；横座标（x轴）为标准麦芽糖含量（微克）
10．根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）
11．计算样品实际麦芽糖浓度（微克/毫升）
【根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）÷0.2（样品容量：毫升）】×10（样品稀释倍数）=微克/毫升
注意事项
1．本产品为25次操作，包括标准液
2．本产品适用于还原性、非还原性糖类、寡糖以及复杂性糖类，但不适合于氨基糖或脱氧糖及其衍生物
3．本产品检测范围为0.2至50微克糖类总量
4．本产品适用于96孔板操作，实际用量按比例减少
5．操作时，须戴手套
6．酸性液（reagent c）具有腐蚀性，注意操作安全
7．孵育时，避免光照
8．如果待测样品浓度过高或过低，可以稀释样品用量；注意在计算实际浓度时，不要忘记稀释倍数调整
9．糖类总量表述方式：微克麦芽糖/毫升；微克麦芽糖/细胞量；微克麦芽糖/总蛋白量
10．本公司提供系列糖类检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感