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大肠埃希菌O157的ISO方法解读

大肠埃希菌o157作为食品致病菌,早就引起人类的注意。2001年,iso发布了iso 16654:2001食品和动物饲料微生物学—大肠埃希菌o157检测的水平方法,对食品和饲料中的e.coli o157检测,给出了标准方法。
o157是e.coli的血清型。我国标准要求在牛肉制品和生食果蔬制品中不得检出。在iso 16654:2001中,e.coli o157的检测分为四步:
1)增菌。采用含新生霉素的改良型tsb肉汤,41.5℃孵育6h,再紧接着孵育12-18h;
2)分离和富集。需要采用针对o157的抗体包被的免疫磁珠;
3)检出:采用ct-smac平板和另一款原理不同的选择性分离琼脂
4)验证:对ct-smac平板上的*阴性菌落和第二款选择性分离琼脂上的e.coli o157典型菌落,通过吲哚试验和e.coli o157抗血清的凝集试验进行验证。
增菌阶段,iso*用modified tryptone soya broth,即改良型tsb肉汤,对此,himedia生产有soyabean bile broth base(货号m1286)和新生霉素添加剂(货号fd290),配方和iso*的改良型tsb肉汤*一致,可以采用。
对于ct-smac琼脂,himedia也生产有相应培养基(货号m1340,加添加剂,货号为fd147),培养结果见下图。o157为无色菌落。但不排除假阳性,如假单胞菌在此培养基中也可产生无色菌落。此时可进行氧化酶试验,在5-10秒内观察结果。假单胞菌为阳性,而o157为阴性。
同时,iso 16654:2001也指出,存在*阳性的e.coli o157不会被ct-smac平板检测到。因此*同时使用另外一款选择分离培养基。此时可考虑himedia的另外一款o157选择性琼脂(显色培养基),货号为mv157,品名为hicrome™ec o157:h7 selective agar base,modified,配合添加剂(货号fd187)一起使用。其检测效果见下图。e.coli o157:h7能旺盛生长,菌落呈深紫色,而普通e.coli呈蓝绿色。
培养基添加剂中的亚碲酸钾能抑制气单胞菌和普罗威登菌生长,新生霉素抑制革兰阳性菌,月桂基硫酸钠抑制伴随的革兰阳性菌群。
在验证阶段,iso也提示,发现存在吲哚阴性的突变菌。因此,也可以考虑用qpcr或多种生化鉴定的方式进行验证。
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