克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的dna片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、ta克隆、gatway克隆、topo克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。因为步骤较多且知识点复杂，在实验的过程中就会遇到各种各种的问题，尤其是各位科研儿们运用最多的同源重组技术。接下来小翌会具体解答一下同源重组中常见的问题，为您的实验提供好方法。
q1一步法快速克隆试剂盒运用到的分子克隆技术是什么？
翌圣hieff clone®系列一步法快速克隆试剂盒运用的是gibson assembly同源重组技术，其使用的同源重组酶兼具外切酶活性、dna聚合酶活性和连接酶活性。
外切酶活性：该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的15-25 bp的同源序列，并沿着5';→3';方向切割dsdna，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。dna聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将片段和载体的5’末端都降解成一样长的粘性末端，同源末端退火配对后，还存在单链的碱基缺口。故需要借助dna聚合酶活性进行修复。连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口缝合。
图1.同源重组原理
q2与传统分子克隆相比，一步法快速克隆试剂盒有什么优势？
应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合canace高保真酶，应用于定点突变；
设计简单：在插入片段的pcr扩增引物5’端引入15-25 bp与载体末端同源的序列即可。
小翌在这里给大家推荐一款翌圣新品，通用型多片段一步法快速克隆试剂盒（cat#10923es），该产品连接效率高，菌落数多，小体系连接不仅省酶，也省片段/载体！
q3一步法克隆试剂盒连接反应总体系20μl，但载体/片段浓度低可否使用小体系连接？
可以。翌圣通用型多片段一步法快速克隆试剂盒10923es，经过大量的内部测试和市场验证，连接反应总体系可以低至6 μl，小体系连接效率高，上市至今客户反馈使用效果好！
小体系高效率重组实验信息：载体大小：5369 bp；目的片段大小：1589 bp。实验数据：
图2. 10923es在10 μl小反应体系下，低浓度载体（30 ng）连接单片段，阳性率100%。a：重组转化平板。b：插入片段pcr鉴定电泳图，泳道1-5分别为菌落1，菌落2，阴性对照，阳性对照（基因组作为模版），阳性对照（pcr纯化片段作为模版）。（上海交通大学）
小体系高效率重组实验信息：载体大小：1600 bp；目的片段大小：1000 bp。实验数据：
图3. 10923es在10 μl小反应体系下，阳性率高。a：重组转化平板。b：插入片段pcr鉴定电泳图。（武汉大学）
小体系长载体高效率重组实验信息：载体大小：10000 bp；目的片段大小：1011 bp。实验数据：
图4. 10923es在10 μl小反应体系下，低浓度长载体（50 ng）连接单片段，阳性率高。a：重组转化平板。b：插入片段pcr鉴定电泳图。（河南农业大学）超短片段高效率重组
实验信息：载体大小：5000 bp；目的片段大小：72 bp。实验数据：
图5. 10923es连接72 bp超短片段（20 ng），菌落数多于竞品，阳性率高。a：重组转化平板。b：插入片段测序鉴定图。（浙江大学）
多片段高效率重组
实验信息：载体大小：5400 bp；目的片段大小：1500 bp，66 bp。实验数据：
图6. 10923es在低浓度载体（45 ng）下连接二片段，菌落数多，阳性率高。a：重组转化平板。b：插入片段测序鉴定图。（中国科学技术大学）
q4一步法克隆连接后无阳性克隆或者菌落数少，是什么原因造成的，该怎么解决呢？
详细阅读下表，为您提供解决方案~
出现问题
原因分析
解决方法
无克隆长出或克隆数较少？
原因1：引物设计错误
①设计原则：同源臂（15-25bp，gc含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物（常规插入片段扩增引物）。
②判断方法：使用翌圣无缝克隆引物设计软件核对
原因2：线性化载体与目的片段使用量错误
线性化载体与目的片段添加比例：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，最适载体使用量为0.03 pmol；最适目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。
注：a、片段长度大于载体时，最适载体与目的片段使用量的计算方式应互换，即目的片段当做载体，载体当做目的片段进行计算。
b、线性化载体的使用量应在50-200ng之间；目的片段扩增产物的使用量应在20-200ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择或最高使用量即可。
原因3：载体与目的片段不纯
推荐对线性化载体、pcr产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如edta）的带入，故dna纯化产物不能使用te进行dna保存，可溶解在ph8.0的ddh2o中保存。未纯化dna加入重组反应体系内的总体积不应超过反应体系体积1/5。
原因4：操作问题或试剂盒失效
推荐做试剂盒自带的阳性对照实验，若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人进行阳性对照实验，进一步排除是否为操作问题。
原因5：感受态细胞效率低，＜107cfu/μg
转化效率检测方法：转化0.1ng质粒（如puc19），生长1000个菌斑，估算转化效率为107cfu/μg。
假阳性—不含插入片段（空载）？
原因1：载体线性化
判断方法：将已制备的线性化的载体转化涂板，如果长克隆较多，则表示线性化 。
解决方案：若线性化 则需优化酶切体系，例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。
原因2：反应体系中混入了相同抗性的环状质粒
判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。
解决方案：pcr扩增产物先用dpni消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。
假阳性—含不正确的插入片段？
原因1：pcr产物混有非特异扩增产物
可能情况：pcr扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。
解决方案：
①优化pcr体系，提高特异性；
②胶回收pcr产物；
③鉴定更多的克隆。
原因2：片段缺失
可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。
解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如ncbi，vectornti等）。
菌落pcr无目的条带？
原因1：菌落pcr引物错误
推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
原因2：pcr试剂mix不稳定，pcr体系或程序不合适
①更换新的pcr试剂盒
②优化pcr体系、程序；
③提取质粒，以质粒做模板pcr验证；
④换成质粒酶切鉴定阳性克隆。
原因3：载体线性化
可能情况：目的片段引物+一端载体通用引物，或另一端目的片段引物扩增无产物，而载体通用引物扩增有产物，且大小符合空载。
解决方案：优化酶切体系。例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。
测序后插入片段有缺失或者突变？
原因1：pcr扩增试剂的高保真性不强，导致位点缺失或突变
快速克隆试剂盒作用于15-25 bp的同源臂上，不会导致片段中间的位点缺失或者突变。
解决方案：更换保真性更高的pcr扩增试剂盒
原因2：在切胶回收过程中，紫外下切胶过久导致突变
减少切胶时间，避免胶长时间暴露于紫外光下。
以上，就是一步法快速克隆试剂盒的faq，请您查收~再加上您的细心、耐心与恒心，做实验必定事半功倍，一气呵成！
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产品定位
产品名称
产品货号
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