rt-pcr实验操作流程
上海信帆生物提供 pcr实验代测，实时荧光定量pcr实验代测，rt-pcr代测。客户只需要提供样本，其他所有试剂都由本公司提供。一般7-10天出结果，提供原始数据，分析数据，实验报告，实验室所用仪器型号，图片，动力扩增曲线等。
rt-pcr实验外包，mrna、mirna、lncrna、dna实验代测
服务内容：
1.制定个性化实验方案：根据不同的实验目的确定实验方案、选定合适的内参；
2.检测类别：mrna、mirna、lncrna、dna；
3.样本抽提及质检：对客户提供样本进行rna抽提，并利用nanodrop进行样本质检；
4.定量pcr预实验：包括样本反转录为cdna、配置pcr反应体系及进行real-timepcr反应；
5.正式定量pcr实验：根据预实验结果进行正式实验；
6.数据分析：采用2- △△ct法进行分析，比较不同样本间差异。
服务要求：
1.请提供组织样本，细胞样本，血浆或血清样本，totalrna；
2.请提供已知的全长基因序列或genebank号；
3.请提供尽可能详细的背景资料：dna/rna来源、基因丰度等。
结果内容：整理好的报告，样本收到之日起5个工作日内反馈质检结果。
结果展示：
样本质检图
溶解曲线：
扩增曲线
数据统计
每个指标有2张图。一张是扩增曲线，另一张是熔解曲线，用来证明pcr扩增中无非特异性扩增
送样运输要求：
1. 样品处理
a. 动物组织：常规组织，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加。将组织剪切成合适大小后（建议组织块长宽高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍体积的rnasolidtm试剂中。（注意：已浸入rnasolidtm试剂中的组织经平衡一段时间后，可从溶液中取出，切成更小的组织块，再重新放回rnasolidtm试剂中；有些比较弱的液体渗透性组织如骨头等，不适合用rnasolidtm试剂进行rna保护。）
b.植物组织：新鲜的叶、果肉、种子最少100 mg。将嫩叶，嫩茎组织切成合适的大小（建议长宽高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍体积的rnasolidtm试剂中。（注意：某些植物组织天生具有的屏障，如叶子表面的蜡层可阻碍rnasolidtm试剂的渗透，对于此类组织，通常需破坏这些屏障层以允许溶液的浸透。）
c.细胞等样本：收集不小于10^6个细胞的沉淀（用pbs清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍体积的rnasolidtm试剂。
d.酵母、细菌等样本：离心弃上清，收集小米粒大小的单菌体沉淀，然后迅速加入适量的rnasolidtm试剂浸没菌体沉淀。
e. rna样品： od260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μl，体积≥20μl，干冰运输。
f.cdna：cdna原液≥20 μl，干冰运输。
real -time pcr，即实时监测pcr扩增产物并进行解析的方法，它是在pcr反应体系中加入荧光物质，并通过real -time pcr检测系统对pcr反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，终对实验数据进行分析处理的方法。real -time pcr自1996年由美国applied biosystems公司推出以来，广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有sybr green 染料、taqman探针法两种。
pcr实验代测，荧光定量pcr代测服主要仪器及耗材
旋涡振荡器 ：上海青浦泸西仪器厂产品
手握式电动匀浆机：德国fluko 公司产品
低温冷冻离心机：sigma（3k15）公司产品
real-time检测仪：abi （abi-7300）公司产品
超纯水分离系统：美国labconco公司
离心管及10μl、200μl、1000μl枪头等常规耗材均为国产；rna提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的depc水浸泡过夜，121℃灭菌30min，烘干后备用。
pcr实验代测，荧光定量pcr代测服实验室试剂的操作
1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(dnase和rnase)污染。
2)所有pcr试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。
3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮na一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮na不抑制扩增反应。
4)所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7)样品准备和前pcr区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
本程序适用于自动pcr操作，可适用于大多数情况，所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，如taq聚合酶等。
引物（各50pmol） 0.2mmol/l dntps（必须使用高质量的dntps，这一点非常重要。dntps经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dntp的量要相等） 模板dna：约0.05～1mg基因组dna或0.002～0.02mg质粒dna taq dna聚合酶（perkin elmer, norwalk, connecticut） 10×pcr缓冲液（500mmol/l kcl，15mmol /l mgcl2，100mmol/l tris·hcl，ph 8.3） 矿物油
电泳所需试剂
【仪器设备】
pcr扩增仪
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml eppendorf 管
紫外线观察装置及照相设备
操作程序
1．在无菌的eppendorf管内加入以下反应物：
2．93℃ 反应2 min后开始以下循环：
93℃变性反应1 min；
50℃退火反应1 min；
72℃延伸反应3 min。
经过17～35循环后，后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。
3．取1～5ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。
应注意的问题及其解决方法
1．pcr反应条件的优化
要优化特定的pcr反应，有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响，从中大家可以得到一些线索以改进反应条件，提高pcr产量和/或特异性，一般情况下，只须改变一两个参数就行了，如ph值和mgcl2浓度。表2-2给出了循环参数对pcr结果的影响。
表2-1 pcr各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响
反应组分 提高产量 提高特异性
模板浓度 增加 减少
引物浓度 高至75 pmol 低至15 pmol
引物长度 － 增加
dntps 各1 mmol/l 各20 mmol/l
tris-hcl (10 mmol/l ph8) ph高至10* ph高至10*
mgcl2 高至4 mmol/l 1.5 mmol/l
dmso － 10%**
甘油 － 2%
甲酰胺 － 5%
taq dna聚合酶*** 高至5u 0.5u
* 效果可能不可预测
** 添加10% dmso时，taq dna聚合酶的活性会被抑制47%，因此反应加大taq dna聚合酶的用量（即5u）予以补偿
*** perkin elmer, norwalk, connecticut
表2-2 可改变以提高pcr产物的特异性和/或产量的循环参数
反应条件 提高产量 提高特异性
循环数 多35个 减至25个
变性* 增至1 min －
引物退火** 降至45℃ 升至72℃
引物延伸*** 在后期循环中延长 维持30s
* 使用基因组dna作模板时，开始几个循环变性应于97℃进行
** 假定tm值为60℃
*** 延伸时间依产物大小而定：1000bp的产物延伸30s即可，产物更长时，按每1000 bp延伸0.5 min计，在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率
2．引物的设计
毫无疑问，引物的碱基组成，长度及其靶序列的同源性是决定pcr成败的首要因素，选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验，对于某一对引物而言尚无通用的规则可严，但应遵守以下原则：
（1）一般性原则：
①长度：15～30bp，其有效长度 [ln=2 (g+c)+(a+t)] 一般不大于38，否则pcr的适延伸温度会超过taq酶的佳作用温度（74℃），从而降低产物的特异性。
②g＋c含量：应在45%～55%之间，pcr扩增中的复性温度一般是较低tm值引物的tm值减去5～10度。引物长度小于20时，其tm值等于4×(g+c)+2×(a+t)。
③ 碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的g或c，否则会使引物在g＋c富集序列区错误引发。
④ 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
⑤引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
⑥特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70%，或少于连续8个的互补碱基。
（2）引物的3’端：
引物的3’端很大程度上影响taq酶的延伸效应，除特殊情况（as-pcr）外，3’端不应发生错配。s. kwok等发现，引物的3’端发生错配时，a:a使产量下降至1/20，a:g或c:c下降至1/100。当末位碱基是t时，即使错配也能引发链的合成，而为a时错配的引发效率低，g、c居间。
因此，引物的3’端碱基好选用a、g、c，而尽可能地避免选用t，尤应避免连续出现2个以上的t。
此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码子的第3位，因此处易发生简并，从而影响扩增特异性。
（3）避开引物的二级结构区：
某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7- deaza-2’-脱氧gtp取代dgtp，有助于pcr成功。
目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从embl或genebank中查找有关基因序列，并依据上述原则对所选用引物进行评价。
3．出现异常结果时的解决思路
在做pcr反应的过程中，由于其酶促反应的本质，影响终结果的因素较多，所以出现一些非预料的结果是可以理解的。下面简单地总结一下在pcr反应结果出现异常时我们应该采取的措施。
（1）电泳检查没有 pcr产物
a．需检查一下taq dna聚合酶是否失活，或是活性太低，还需查一下在加样过程中是否向体系中加过taq dna聚合酶；
b．需检查一下所使用的引物，看其序列设计是否正确，是否碱基组成不平衡；
c．需要检查一下pcr反应过程中模板是否变性充分，尤其在前几个循环中是否变性充分；可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间；
d．需检查一下在pcr反应体系中是否有taq dna聚合酶的抑制剂，如sds污染等等；
e．需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以预先加热使之失活。
（2）电泳检查出现引物二聚体区带
a．需检查一下两个引物的3’端是否互补，或者是否有相类似的回文结构；
b．需检查一下使用的引物是否太短，可以予以适当的延长；
c．需检查模板的用量，模板以10－4个拷贝为佳，模板太少会造成引物相对过量；
d．适当地降低引物的浓度，引物浓度过高是出现引物二聚体的主要原因；
e．循环次数太多也易形成引物二聚体，可以适当地减少循环数；
f．可以将复性温度提高一些以减少引物二聚体形成。
（3）电泳检测pcr产物呈片状（smear）
a．需检查一下taq dna聚合酶的用量，适当地减少taq酶的量有助于特异性条带扩增；
b．可以提高反应的退火温度，或者直接采用两个温度的pcr（68℃退火和延伸，94℃模板变性）；
c．适当地降低mg 2+ 的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用；
d．适当地减少反应退火的时间和延伸的时间；
e．适当地减少循环次数也会有效果；
f．可以尝试使用巢式引物pcr（nested primer pcr）。
（4）电泳检测pcr产物出现其它非特异性条带
a．需检查一下引物的3’端是否有连续排列的g或c；
b．可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度pcr方法进行扩增；
c．可以降低taq dna聚合酶的用量，同时也降低引物的浓度；
d．可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间；
e．可以适当地增加或减少一些mg 2+ 浓度。
4．假阳性
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、dna抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
预防各种污染的措施主要有：（1）工作区隔离。（2）改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。（3）操作程序合理化，如后加阳性对照等。
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rt-pcr实验操作流程
关键词：振荡器 匀浆机 冷冻离心机 扩增仪 微量离心机