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组织3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
组织3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用乙酰辅酶a和乙酰乙酰辅酶a，在hmg-coa合成酶的催化下，使烯醇式乙酰乙酰辅酶a减少致吸光峰值的降低，即采用光度法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液、微粒体，或纯化酶样品3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
3-羟-3-甲戊二酰辅酶a合成酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coa synthase；hmgs；ec2.3.3.10）属于酰基缩合酶（acyl condensing enzyme）家属中的成员之一，是胆固醇通路和甲戊二羟酸通路的重要的限速酶之一，调节胆固醇、类异戊二烯脂以及酮体分子的产生，受到固醇和非固醇分子的反馈抑制。hmg-coa合成酶存在于各种动物、昆虫、植物、真菌，以及某些细菌中。通过催化乙酰辅酶a和乙酰乙酰辅酶a的生物克莱森缩合反应（claisen condensation），生成3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coa；hmg）。动物hmg-coa合成酶分成两种亚型：线粒体型和胞浆型。线粒体型占主要，与酮体生成相关，而胞浆型与胆固醇和类异戊二烯脂生物合成相关。细菌hmg-coa合成酶与细胞壁合成、电子传递等有关，例如十一癸烯醇（undecaprenol）、甲萘醌（menaquinone）和泛醌（ubiquinone）等分子合成。hmg-coa合成酶异常，会导致糖尿病酮症酸中毒（diabetic ketoacidosis；dka）。基于底物乙酰辅酶a和乙酰乙酰辅酶a，在hmg-coa合成酶的催化下，缩合产生3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa），其烯醇式（enol form）乙酰乙酰辅酶a的减少，通过吸光峰值的降低变化（303nm 波长），来定量分析3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶的活性。3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶反应系统为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
阴性液（reagent e） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液（reagent b）、缓冲液（reagent c）、反应液（reagent d）和底物液（reagent e）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（reagent d）和底物液（reagent e）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品制备
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析
实验步骤
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重500毫克
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（reagent a）清洗
4．（选择步骤）抽去清理液
5．移入到一个液氮冻存管
6．即刻放进液氮罐过夜
7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8．放进一个15毫升锥形离心管
9．加入置于冰槽里的xx微升裂解液（reagent b）
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－hl30030.1）
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长303nm，间隔5分钟，读数2次（共10分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化
3．缓冲液（reagent c）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．上下倾倒数次，混匀
4．在30℃温度下孵育3分钟
5．加入xx微升阴性液（reagent e）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－10分钟读数）
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．上下倾倒数次，混匀
4．在30℃温度下孵育3分钟
5．加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）
6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－10分钟读数）
五、计算样品活性
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent c）到96孔板里
3．分别加入xx微升反应液（reagent d）
4．轻轻摇动96孔板
5．在30℃温度下孵育3分钟
6．分别加入xx微升阴性液（reagent e）或待测样品（200微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
7．轻轻摇动96孔板
8．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和10分钟读数
9．活性计算：
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议使用比色皿测定
5．样品须澄清，至关重要
6．加样后3秒内光度测定
7．测定值由高到低变化；测定持续10分钟
8．光度测定后，比色皿须清洗
9．样本测定0分钟读数高于10分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－hl30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg-coa）合成酶单位活性定义为：在30℃，ph 7.8条件下，每分钟内缩合产生3-羟-3-甲戊二酰辅酶a（hmg）所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列甲戊二羟酸（mevalonate）通路分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感