研究背景肠道是人体重要的消化器官,肠指的是从胃幽门至的消化管,是消化器官中最长管道，人体肠道结构主要包括小肠和大肠。肠道疾病非常常见，如肠梗阻、慢性炎症性肠病、结直肠癌等等，其中结直肠癌已成为威胁人类健康最严重的疾病之一。因此，肠道的研究是现在非常热门的领域，有着广阔的应用前景。
培养方案文献分析一2009年，hans clevers研究团队利用来源于肠隐窝的单个干细胞（lgr5+）或单个隐窝结构，在体外成功培养出3d肠道“类器官”。离体的肠道干细胞或隐窝在基质胶、小分子化合物、细胞添加剂以及多种生长因子中培养可不断增殖，具有自我更新及分化能力，能够分化形成多种肠道成熟细胞，在肠道疾病模型建立和研究中发挥重要的作用。[1]
图1. 单细胞在单孔中的集落形成效率[1]
1. 隐窝分离，细胞分离和细胞培养
通常在含有2mm edta的pbs中，4℃下孵育30min，从小鼠小肠中释放隐窝。对分离的隐窝进行计数并成球。在24孔板中，加入基质胶、生长因子（10-50ng/ml egf、500 ng/mlr-spondin 1、100ng/mlnoggin）孵育。
2. 分选实验
分离的隐窝37℃孵育45min，分离后的细胞通过孔径为20μm的细胞过滤器。将分选的细胞收集在隐窝培养基中，并加入含有jagged-1多肽（1μm）的基质胶中，每孔1个细胞（在96孔板中，含5 ml基质胶）。
3. 隐窝培养基
48孔板加入250μl培养基，96孔板100 μl培养基，并且添加小分子化合物y-27632（10 μm），每隔一天添加一次生长因子，每4天更换一次培养基。
4. 传代
将类器官从基质胶中取出，机械分离成单隐窝结构域，然后转移到新鲜的基质胶中。每1-2周进行一次，分割比例为1：5。[1]
图2. 肠隐窝培养系统的建立[1]
图3. b、c、d分别为培养第5天、14天、3周后的情况，e为隐窝样器官的示意图[1]
在培养小鼠结肠类器官时，培养基中需要添加p38 mapk激酶抑制剂（sb-202190）、tgf-β抑制剂（a 83-01）、rho激酶抑制剂（y-27632）和gsk抑制剂（chir-99021）、jagged-1等小分子化合物，以及egf、r-spondin-1、noggin和wnt-3a等生长因子。[1][2]
研究团队根据肠上皮细胞的生长需求来设计的这样一个培养系统，wnt信号传递是隐窝增殖的关键要求，而wnt激动剂r-spondin1在体内诱导隐窝明显增生，表皮生长因子（egf）的信号转导与肠道增殖有关，noggin的转基因表达诱导了隐窝数量的增加。rho激酶抑制剂y-27632抑制胚胎干细胞失巢凋亡，降低细胞死亡率。细胞间的notch信号对于维持隐窝的增殖至关重要，我们还提供了一种notch激动性肽（jagged-1）。[1][2]
文献分析二2022年hans clevers团队创新性地引入了il-22来优化hsios培养基组成，极大地提高了肠道类器官的出芽比例，上调潘氏细胞的表达水平，更好地模拟人体内肠道的组成性表达成分。如下图。
图4.人结肠培养（小分子化合物nicotinamide、sb 202190和a83-01对培养的影响）[2]
图5.人结肠腺癌细胞的培养过程[2]
文献分析三类器官培养和药物刺激的hsio培养基中需要添加的小分子化合物、添加剂和细胞因子，分别为：b-27（1%），n-乙酰半胱氨酸（1mm），烟酰胺（10 mm），alk 4/5/7抑制剂a 83-01（500 nm）,p38抑制剂sb 202190（3-10 μm），前列腺素e2（10 nm），chir-99021（3-10 μm），rho激酶抑制剂y-27632（10 μm）和primocin（100 μg/ml），bp-1-102，ly294002，mk-2206，雷帕霉素，n-2，谷氨酰胺，hepes，青霉素/链霉素，r-spondin，noggin（2%）,人egf（50 ng/ml），人il-22（2 ng/ml），具体如下图所示（图六）。[3]
化合物名称
货号
a 83-01
53002es
sb 202190
53005es
chir-99021
53003es
y-27632 dihydrochloride
52604es
gastrin i (human)
53007es
n-acetyl-l-cysteine
50303es
nicotinamide烟酰胺
51402es
bp-1-102
53174es
ly294002
52403es
mk-2206 2hcl
53008es
rapamycin雷帕霉素
52404es
prostaglandin(pg) e2 前列腺素e2
60810es
penicillin-streptomycin (10,000u/ml)
60162es
hepes (1 m)
60117es
l-alanyl-l-glutamine solution,200mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺,200mm
60701es
primocin
60281es
b27 supplement (50x)
60703-60705es
n-2 supplement,serum free,100x n-2无血清添加剂,100x
60706es
recombinant human il-22
90121es
recombinant murine il-22
90155es
recombinant human wnt -3a protein
92276es
recombinant human noggin protein
92528es
recombinant human egf
92701es
培养步骤人肠类器官的培养1.重悬隐窝基质胶混合物，孔板中加入一定量的混合物和隐窝培养基（如24孔板可加入50 μl混合物和500 μl培养基）；2.用离心管转移到超净工作台里，pbs（含双抗）润洗2-3次，将肠粘膜转移至含有edta（2mm）的溶液中，置于4℃，小肠消化约30min，结肠消化约1h；3.将消化好的小肠粘膜转移至离心管中，加入pbs，摇晃均匀后用70μm的细胞过滤筛过滤，1000r/min室温离心5min，结肠隐窝无需过滤；4.弃上清，加入培养基重悬沉淀，计数，隐窝的数量约10个/μl为佳；5.加入一定量的悬液到离心管中，室温离心5min；6.加入预冷的基质胶混合物（基质胶：培养基为2:1）重悬沉淀；7.将重悬液按一定量接种在预热的孔板中；
8.每个孔加入一定量的预热的隐窝培养基，37℃培养1-2周。
人肠类器官的传代9.在培养板中，每孔加入一定量的培养基，用枪头将基质胶小心的刮出，取悬液，转移到离心管中；10.将要传代的隐窝置于冰上5-10min；11.用枪头吹打基质胶，反复进行，直至基质胶被打碎，中间尽量避免气泡产生；
12.将消化好的小肠粘膜转移至离心管中，加入pbs，摇晃均匀后用70 μm的细胞过滤筛过滤，1000 r/min室温离心5 min，结肠隐窝无需过滤；
13.弃上清，加入培养基重悬沉淀，计数，隐窝的数量约10个/μl为佳；
14.加入一定量的悬液到离心管中，室温离心5 min；
15.加入预冷的基质胶混合物（基质胶：培养基为2:1）重悬沉淀；
16.可按1：1- 3：1进行传代培养；
人肠类器官的冻存17.将需要冻存的类器官置于冰上5-10min；18.收集类器官，离心后弃上清；19.加入冻存培养液重悬类器官，分装至冻存管中，置于-80℃，24 h后置于液氮中长期保存。
利用肠类器官构建的体外肠道模型，可以极大的推动对肠道疾病发生发展的研究，为高通量药物筛选、新物研发、药物功能检测、靶向治疗、个性化精准医疗、再生医学提供新的重要的研究平台和途径。肠道类器官的出现，为肠道疾病的研究和治疗打开了一扇全新的大门。
参考文献[1] sato t,et al. single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.nature. 2009 may 14;459(7244):262-5. doi: 10.1038/nature07935. epub 2009 mar 29. pmid: 19329995.
[2] sato t,et al. long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.gastroenterology. 2011 nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. epub 2011 sep 2. pmid: 21889923.
[3] he gw,et al. optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation.cell stem cell.2022 sep 1;29(9):1333-1345.e6. doi: 10.1016/j.stem.2022.08.002. epub 2022 aug 23. erratum in: cell stem cell. 2022 dec 1;29(12):1718-1720. pmid: 36002022; pmcid: pmc9438971.