6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6pgdh）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：ba1008
产品规格：100管/96样
产品简介：
磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（g6pdh）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6pgdh）依次催化nadph合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6pgdh逆境生理中具有重要作用。6pgdh催化6-磷酸葡萄糖酸和 nadp+生成nadph，nadph在340nm有特征吸收峰，而nadp+没有；通过测定340nm吸光度增加速率，计算6pgdh活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
产品组成
规格
保存条件
试剂一
液体60ml×2瓶
4℃
试剂二
粉剂×1支
-20℃
试剂三
粉剂×1支
4℃
溶液的配制：
1.试剂二：临用前配制，加入2.2 ml试剂一，混匀；
2.试剂三：临用前配制，加入2ml试剂一，混匀
需自备的仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔uv板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤（仅供参考）：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清粗酶液，待测。
二、测定步骤
1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2.试剂一置于37℃水浴预热30min以上。
3.加样表：（在微量石英比色皿/96孔uv板中依次加入）
试剂名称（μl）
测定管
空白管
样本
20
-
蒸馏水
-
20
试剂一
140
140
试剂二
20
20
试剂三
20
20
于340nm处测定3min内吸光值变化，第0s吸光值记为a1，第180s吸光值记为a2。记δa测定=a2测定-a1测定，δa空白=a2空白-a1空白。
三、6pgdh活力单位的计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol nadph的酶量为1个酶活单位。
6pgdh酶活性(u/mg prot) =[(δa测定-δa空白)×v反总÷(ε×d)×109]÷(cpr×v样)÷t
=536×(δa测定-δa空白)÷cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol nadph的酶量为1个酶活单位。
6pgdh 酶活性(u/g质量) =[(δa测定-δa空白)×v反总÷(ε×d)×109]÷(v样÷v样总×w)÷t
=536×(δa测定-δa空白)÷w
ε：nadph摩尔消光系数，6.22×103l/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；v反总：反应体系总体积，0.0002l； cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/ml，需要另外测定；v样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02ml；v样总：提取液 体积，1ml；t：反应时间，3min；w：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol nadph的酶量为1个酶活单位。
6pgdh酶活性(u/mg prot)=[(δa测定-δa空白)×v反总÷(ε×d)×109]÷(cpr×v样)÷t
=893×(δa测定-δa空白)÷cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol nadph的酶量为1个酶活单位。
6pgdh 酶活性(u/g质量) =[(δa测定-δa空白)×v反总÷(ε×d)×109]÷(v样÷v样总×w)÷t
=893×(δa测定-δa空白)÷w
ε：nadph摩尔消光系数，6.22×103l/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；v反总：反应体系总体积，0.0002l； cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/ml，需要另外测定；v样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02ml；v样总：提取液体积，1ml；t：反应时间，3min；w：样本质量，g。
注意事项：
1.试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在4℃，可保存1周。
2.样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；
3.若样本初始（0s）读值大于0.5且δa测定小于0.1，可尝试将样本进行稀释后测定。
4.使用96孔板测定时，可根据样本数量将试剂一（预热后）、二、三预混为工作液，因是根据反应速率计算酶活，为保证每个样本的反应时间尽量一致不推荐同时测过多样本。