在用血液标本进行基因表达研究时,需要及时把新鲜血液中有核细胞的rna提取出来。全血还不能直接放到-80℃保存,即使在-80℃保存,全血中的rna也容易发生降解。传统的提取新鲜全血rna方法是把先把有核细胞从全血中分离出来,需要加白细胞分离液、离心等步骤,比较繁琐,在临床医院往往难以实施,的rna提取方法为rn01 tripure ls裂解全血提取rna。
(一)淋巴细胞分离液分离单个核细胞:
外周血及骨髓(抗凝)利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞
(1)外周血送检需5-10ml抗凝血,骨髓需1-3ml抗凝,常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定,一般需要5x106单个核细胞以上)。
(2)加入等体积无菌pbs于外周血及骨髓中充分混合,形成细胞悬液;
(3)加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。
(4)吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min。
(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)中的mnc入另一离心管中。无菌冷pbs洗2次,zui后1次洗涤可以将细胞悬液移入ep管中,离心去上清直接或加入trizol混匀后-70℃冻存,或直接提取rna(可以先进行细胞计数以保证细胞数)。
(二)红细胞裂解液分离单个核细胞:
(1)血液收集:用肝素抗凝,因为edta可能会对后续的pcr有影响,因为edta会螯合pcr反应中的mg2+,也可以根据实验的具体要求看选择怎么样的抗凝。
(2)白细胞的分离:一般选择1.5ml新鲜的血液,或选取冷冻的5ml的血液(冷冻血液的保存:先液氮速冻,再置于-80°保存),或隔天的5ml的血液,就可以分离到比较多的白细胞了。可以选择溶红素或红细胞裂解液按一定的比例(1:3或1:5)分离白细胞,一般在3500转离心6分钟即可,效果不好的话,可以重新裂解一次。
(3)分离得到的白细胞,立刻用质量好的trizol裂解白细胞,如果不能马上提取的话,可以置于-20或-80保存,过后抽提(选择一般的组织或细胞的rna抽提elisa试剂盒即可)。
(三) rn01 tripure ls裂解全血提取rna
液体样本rna提取试剂rn01 tripure ls。可以直接裂解全血提取rna,避免了先裂解白细胞可能导致的rna降解,也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。
(1)在临床上采血时,可以先把tri pure ls reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。
(2)血液样本可以先抗凝处理(edta抗凝或者其他抗凝方式都可),然后取250ul全血样品加入到750ul的tri pure ls reagent中,用移液枪反复抽打并振荡混匀,在室温裂解5min-10min,直至血细胞充分发生裂解。
(3)此裂解液保存在-20℃下可达2个月,-80℃可达半年,4℃可以1天。
(4)样品在15 -30°c条件下孵育5分钟以使核蛋白体*分解。
(5)每1ml tripure加0.2ml氯仿,盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~3分钟。在2~8°c下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层:下层*-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。rna在于水样层,水样层的容量大约为所加tripure 容量的60%。
(6)将水样层转移到新ep管中(如果希望分离dna和蛋白,有机层同样要予以保留),zui初均化时的每1ml tripure 对应0.5ml异丙醇,将混合的样品在-15 -30°c条件下孵育10分钟;
(7)在2~8°c下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟(rna沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底;
(8)移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤rna沉淀一次(每1ml的tripure 至少加1ml的75%乙醇),在2~8°c下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟;
(9)简单干燥rna沉淀(空气干燥或真空干燥5~10分钟,不能让rna沉淀*干燥那样会极大地降低它的可溶性)。部分溶解的rna样品其a260/280比值<1.6。用移液管尖分几次移取无rna酶的水或0.5%sds溶液来溶解rna,rna还能被甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在–70°c。
