a.dna模板：
·尽量使用高质量、纯化后的dna作为模板
·需要提高保真度时，可使用较高的dna模板浓度并减少循环数
·模板用量：以50 μl反应体系为例——
人基因组dna：0.1~1.0 μg
大肠杆菌基因组dna：10~100 ng
lambdadna：0.5~5 ng
质粒或病毒dna：0.1~10 ng
b.引物设计原则：
·引物长度要满足特异性需要，一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时最好在24~30个碱基之间；
·当引入克隆位点时，引物末端应额外增加3个以上碱基；
·(g+c)%含量应尽量控制在40~60%，两条引物的(g+c)%含量应尽量接近；
·引物中gc碱基分布均匀；
·尽量避免相同碱基连续出现三次以上，3’端应避免使用a或t；
·避免引物内部自身配对形成二级结构；
·正反向引物之间应避免配对碱基，尤其是3’端的三个碱基，否则易生成引物二聚体(primer dimer)；
·两条引物的解链温度（tm）值应在42~65℃之间，而且两条引物间最好相差不超过5℃；
·引物tm值的计算方法：
20 nt以下：tm = 2℃x (a + t) + 4℃x (g + c)
20 nt以上：tm = 81.5 + 0.41 x (gc%) -600/nt(nt：引物的碱基数)
·引物用量：
·0.1~1.0 μm，通常可以0.2 μm起始，根据体系不同调整用量；
·使用简并引物、随机引物时，需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大，特异性将降低；
·模板较大较多，或结构较复杂(如人基因组dna)时，需减少引物用量以提高特异性；
·模板较小较少(如质粒模板)时，增加引物用量可提高产量。
c.核苷酸（dntps）：
·常规dntps浓度为每种核苷酸0.1~1.0 mm，通常可以0.2 mm起始，根据体系不同调整用量；
·低浓度（0.05~0.1 mm）可增加保真性，但会降低产量；
·高浓度提高产量，尤其是长片段pcr，但会降低保真度。
d.镁离子浓度
·对于taq dna聚合酶，镁离子的最佳浓度为1.5~2.0 mm；
·最佳浓度取决于模板、缓冲液、dna和dntps（每一种都有可能鳌合镁离子）；
·镁离子浓度过低，会降低产量；
·镁离子浓度过高，会增加非特异性pcr产物；
·优化镁离子浓度时，通常以0.5 mm梯度递增，最高到4 mm。
e.taq dna聚合酶浓度
·推荐使用浓度为1~2.5 u/50μl反应体系。
f.起始反应
·在冰上配制反应体系；
·最后加聚合酶；
·将热循环仪预热至变性温度(94℃)后，放入pcr管，立即进行反应。
g.变性温度与时间
·通常于94℃初始变性，使dna双链全打开；
·变性时间通常为15~30秒；
·避免长时间或高温度孵育；
·高gc含量模板可提高变性温度至98℃。
h.退火温度与时间
·通常情况下，退火温度为引物tm值减5℃，在55~60℃之间；
·提高退火温度有利于减少非特异性条带；
·常规退火时间为15~30秒。
i.延伸温度与时间
·延伸反应通常在72℃下进行。
·taq酶的延伸时间大约为15~30秒/kb dna；
·产物小于1 kb时，建议延伸时间为30~60秒；
·产物大于3 kb或反应超过30个循环时，可能需要更长的延伸时间。
典型的循环条件：
预变形94℃2分钟
94℃30秒，
55℃30秒，
72℃1分钟/1 kb，25~30个循环
72℃5分钟
注：上述反应条件适用于普通taq dna聚合酶催化的pcr反应。当dna模板富含gc、具有复杂二级结构、低浓度或产物>5 kb时可能需要改变相应条件