心脏作为人体的重要器官，心肌收缩能力对其功能至关重要。心肌细胞（cms）的收缩活动中断可能导致各种心脏疾病，同时，以人工手段改变心肌收缩能力也是治疗各类心脏疾病的常用方法。通过人多能干细胞分化而来的心肌细胞（hpsc-cms），由于其易于培养且存活时间长，十分适合作为心肌细胞体外生理模型。然而，未经处理的hpsc-cms肌原纤维排列混乱，这限制了它们的收缩能力，即对成熟cms的模拟能力。
今天，与大家分享一篇发表在pnas（if=15.7）上的文章“contractilityof single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends onphysiological shape and substrate stiffness”，作者通过设置不同生理形态与基质硬度改善了hpsc-cms的收缩能力，减小与成熟cms之间的差异，并深入研究了促使hpsc-cms成熟和影响肌节功能的内在因素。
图1 不同横纵比hpsc-cms的lifeact标记肌动蛋白成像
在10 kpa(心肌细胞正常基质硬度)聚丙烯酰胺水凝胶中培养横纵比为1:1、3:1、5:1、7:1的矩形hpsc-cms，并保持其总面积为2000 μm2。经lifeact染色后可清晰的看到肌动蛋白(f-actin)在高横纵比的细胞中有序排列，且随着长径比的增加，排列越规整，这将有助于提高hpsc-cms的收缩性及机械功率。
图2 牵引力显微镜计算zuida牵引力空间分布图3:1、5:1、7:1、普通hpsc-cms和1:1 hpsc-cms (左)，不同横纵比hpsc-cms σ|fc|的变化图(右)
牵引力显微镜计算所得的基质牵引力数据显示横纵比为7:1的细胞收缩力(σ|fc|)zuiqiang，且平均收缩速度与其他hpsc-cms保持一致，即可知此时hpsc-cms的机械功率的差异主要体现在收缩力上，二者成正比。随着横纵比增大，hpsc-cms收缩的zuida速度有所增加，表明定形处理有助于提高机械功率与收缩性。在2000 μm2的未定型hpsc-cms中，其收缩力与1:1的hpsc-cms相似，而肌原纤维的不规则分布则使其收缩力仍然小于3:1的hpsc-cms。
图3 lifeact标记肌原纤维线扫描成像(左)，每μm肌节的平均收缩力(中)，肌原纤维轴向运动比例(右)
此外，经过对细胞收缩与舒张长度的测量，横纵比与肌节收缩的程度成正相关。通过粒子示踪测速法追踪f-actin，量化hpsc-cms在主轴x与副轴y上的运动情况[u(x)/v(y)]。结果显示，高横纵比的细胞在主轴方向收缩能力zuiqiang，这归因于肌原纤维的大范围有序排列使得肌节缩短，zuida限度地增加了hpsc-cms的机械输出。轴向高度有序的肌原纤维排列也是cms成熟的一个标志，此时hpsc-cms可更好的对cms进行模拟。
图4 不同细胞形态与基质硬度下收缩力对比(左)，6 kpa下hpsc-cms 肌原纤维弯曲(中)，35 kpa下肌原纤维部分断裂(右)
之后，作者又制备了模拟胚胎心肌(6 kpa)和纤维化心肌(35 kpa)的水凝胶用以研究不同硬度基质下hpsc-cms的收缩情况。如图所示，35 kpa下细胞的收缩力zuidi仅为前二者的10%。一般情况下，细胞膜张力随横纵比的增加而增大，而胞内张力随基质硬度增加而增加。此时由于高基质硬度造成了胞内张力超过阈值，大量肌原纤维发生断裂(25%)，相似的，在6 kpa下，低张力可使肌原纤维产生松弛与弯曲。为了证明张力阈值的存在，通过手动拉伸水凝胶提升细胞膜张力，在拉伸5-10%时细胞力增强约10%，达到14%时肌原纤维开始断裂，之后细胞停止收缩或收缩力急剧下降。同时，在35 kpa下培养的hpsc-cms随着胞外钙离子(刺激细胞收缩)浓度的增加，肌原纤维断裂率明显上升，表明高硬度抑制了细胞收缩性，否则将会有更多肌原纤维断裂(＞50%)。
图5 edta、诺考达唑、ml-7和bdm处理后hpsc-cms的变化情况(a)，对应处理后细胞长度变化(b)，肌联蛋白(titin n2a, n2b)与肌钙蛋白(tni, 替恩替)在不同条件下(patterned, glass, 10kpa, 35kpa)的表达情况(下侧)
为了研究胞内张力对肌原纤维的有序排列是否有影响，使用edta培养hpsc-cms以消除其胞内张力，发现肌原纤维的松弛和肌节周期性组织会随着培养时间的延长而逐渐松弛和消失。之后，利用诺考达唑或细胞松弛素d(抑制肌球蛋白)抑制细胞骨架聚合，或通过其他小分子再次消除胞内张力(atp酶抑制剂抑制非肌肉肌球蛋白ii型与肌动蛋白的结合，ml-7抑制非肌肉肌球蛋白轻链激酶，或bdm抑制非肌肉肌球蛋白的atm酶)。结果显示只有诺考达唑处理后的hpsc-cms内部肌原纤维重新有序排列，表明肌球蛋白与肌动蛋白在肌原纤维的有序排列中起到了重要的作用。而后，又测定了肌联蛋白(titin n2a, n2b)与肌钙蛋白(tni, )在不同条件下(是否经过塑形、基底的种类与硬度)的表达情况，结果表明基质硬度和细胞形态可通过调节肌节张力的机制协同调节hpsc-cms的收缩性。
图6 7:1和未塑形hpsc-cms的钙离子瞬变图及线粒体分布图(上侧)，电生理测试，定量(q)rt-pcr 测试及暗场横断管成像(下侧)
另外，随着肌节活性的提高，hpsc-cms的成熟度也进一步的改善。钙瞬变、线粒体的分布、电生理学特性和横断管的形成等都可以显示hpsc-cms的成熟情况。如图所示，在7:1的hpsc-cms中，钙离子随着细胞的收缩而产生轴向移动，而线粒体主要分布于细胞核周围及细胞两端，在电生理测试中，膜片钳记录处理后的hpsc-cms具有更低的静息膜电位、更高的动作电位振幅和更高的zuida上升速率，同时，还可以在hpsc-cms表面找到沿细胞膜分布的横断管结构，这些特征都表明hpsc-cms与正常的人心肌细胞十分相近。再次体现了其作为体外生理模型的优势。不过，对单细胞进行的定量(q)rt-pcr结果表明，在基因表达的层面，是否经过pattern处理的hpsc-cms并未产生明显的区别。
总结
本研究表明，在hpsc-cms中，可以通过调节生理形态和基质硬度来影响细胞张力(调节收缩力，建立和维持肌原纤维排列)，使得肌节缩短并转化为更高的机械输出。横纵比为7:1的hpsc-cms的肌节活性zuigao且肌原纤维排列zuiwei规整，而收缩能力的增强也表明其更加接近成熟的cms。同时，经处理后的hpsc-cms在电生理特性、钙瞬变、线粒体分布和横断管结构的存在与成熟的cms更为相似。这进一步提升了patterned-hpsc-cms在体外心脏健康和疾病模型研究中的潜力。
参考文献:
ribeiro a j s , ang y s , fu j d , et al. contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness[j]. proceedings of the national academy of ences of the united states of america, 2015, 112(41).