多能干细胞（ipsc）经诱导可分化为心肌细胞（cm），从而产生人心肌的体外细胞模型即ipsc-cm。常规2d培养的ipsc-cm表型通常不成熟。3d培养可提高ipsc-cm的表型成熟度，但通常操作过程复杂，对设备要求高，细胞产量小，研究效率低。来自英国的研究人员matthew p. burnham等通过添加磁性金-铁氧化物纳米粒可将磁性细胞球精确定位在记录电极上，并基于此方法研究了共培养、胞外缓冲液成分、电起搏等因素对ipsc-cm的影响。以“a scalable approach revealsfunctional responses of ipsc cardiomyocyte 3d spheroids”为题发表在slas discovery上。
研究背景
成年心肌在细胞层面主要包括表型成熟的心肌细胞（cm）以及紧邻的心肌成纤维细胞。诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（ipsc-cm）为建立成人心肌细胞体外模型奠定了重大研究基础。但该模型中的ipsc-cm细胞通常表型不成熟，存在具有自发性qiboqi活性但搏动力度不足，肌浆网（sr）钙（ca2+）调节发育不*和肌膜离子通道表达不足等缺陷。
大量研究表明在2d单层细胞培养条件下，ipsc-cm体外表型成熟度会受到限制。而通过模拟各种生理条件如：3d矩阵和结构化支架、与非肌细胞支持细胞共培养、在弹性基层上的电起搏收缩行为和机械调节、以及适当利用能源等均能显著提高ipsc-cm的表型成熟度。对3d ipsc-cm功能和结构研究方法很多，如ipsc-cm与非肌细胞支持细胞或细胞外基质蛋白一起形成条状或环状，用光学方式追踪其收缩性；通过在低粘附力表面或在悬滴中培养，ipsc-cm细胞能够自我组装形成3d结构，与视频显微术相结合也可检测其收缩性；还有基于染料或光遗传的报告分子、微电极、多电极阵列或力传感器等方法来研究3d ipsc-cm的结构。但这些方法操作过程复杂，对设备要求高，效率极低，导致ipsc-cm产量偏低。
因此想要进行更高效的ipsc-cm进行研究，我们需要新方法。在低粘附力表面或水凝胶上形成的球状体/微组织是zuijiandan的获取ipsc-cm 3d结构的方法，但由此产生的球状结构处于自由漂浮状态，跳动活跃难以操作，也难以可靠检测。本文研究人员通过将ipsc-cm与非肌细胞支持细胞和磁性金-铁氧化物纳米颗粒组装在一起形成unique共培养细胞球，并使所得的共培养细胞球带有磁性，能够被钕磁铁阵列定向和定位，从而将细胞球精确定位到2d ipsc-cm单分子层功能测量的96孔传感板的感应电极上（cardioexcyte96 platform23 nanion technologies gmbh），通过记录收缩力（阻抗）和细胞外场电位（efp）检测细胞球生理指标。这是shouci以整板形式进行3d ipsc-cm功能检测，同时结合96孔液体处理平台和声学分配软件，实现了高通量操作。为研究3d ipsc-cm模型是否可以应用于成年心肌的更多生理学研究，研究人员还探究了成纤维细胞共培养（人原代培养的成纤维细胞和小鼠成纤维细胞系）、细胞外缓冲液组成和电起搏等因素的影响，证明该方法具有高效、可扩展性。
结果
为构建3d ipsc-cm细胞球模型，研究人员向ipsc-cm和成纤维细胞共培养体系中加入金-铁氧化物纳米粒子，形成的磁性细胞球可被磁性阵列吸引并定位到感应电极上，检测率可达95%以上，且定位附着后的细胞球依然能够维持良好的3d结构。
图1. ipsc-cm共培养球形团簇的自组装及平板阵列的制备。（a）工作流程示意图，将共培养细胞在超低附着装配板中与铁-金纳米粒子一起组装成共培养细胞球，并使用与电极位置对齐的定制磁铁阵列将球体沉积到记录电极上，然后将其转移到传感器板上（cardioexcyte96 platform23 nanion technologies gmbh）。（b）ipsc-cm细胞在接种后4天内（第1-4天）以ipsc-cm单独或与成纤维细胞（fb）共培养形式组装到传感器板中。（c）钕磁铁阵列示意图（尺寸与传感器板中12×8电极阵列位置相同）。(d) 石蜡切片he染色表明金-铁氧化物纳米粒子进入球体（白色箭头），且球中心无坏死。(e) ipsc-cm球体附着到包被过的传感板电极4天后，进行中性红染色，发现3d结构保持良好，并无2d单层细胞出现。
研究人员对ipsc-cm 3d磁性细胞球模型进行了多项成熟度检测。通过传感器阻抗检测，发现加入金-铁氧化物纳米颗粒并不会改变细胞球的搏动特性，培养2天的细胞球搏动稳定，搏动率为0.8±0.04hz或49±2.4 bpm，幅度<5 ohm。400 nm异丙肾上腺素（l型ca2+通道抑制剂）处理后搏动频率提高，1μm维拉帕米（β-肾上腺素受体激动剂）处理后搏动停止，与已知的药理学作用一致（图2，表1）。在给药方面，研究人员基于96孔液体处理平台（cardioexcyte96 platform23 nanion technologies gmbh）构建了一种高效配液给药方法，从培养记录板中吸出一部分温热的培养基，将其与dmso储备溶液快速混合，然后再次分配回培养记录板。该方法操作简单，用时短，可做到同时给药且浓度均一，极大地避免了人工操作带来的各种影响，且给药期间记录板中温度变化在0.5℃范围内。
图2 通过阻抗感应检测ipsc-cm球的收缩参数。(a)单个球收缩和规律搏动时的10s阻抗曲线向下偏转。(b)搏动特征在较长时间内保持稳定。(c)蓝色曲线：400 nm异丙肾上腺素；黑色曲线：1 μm维拉帕米；灰色曲线：对照。(d)c图的平均数据。(e)使用自动液体操作进行累计添加维拉帕米，产生的浓度-响应数据，n=9次重复。研究人员探究了成纤维细胞共培养对ipsc-cm细胞球的影响。发现与小鼠和人成纤维细胞共培养，ipsc-cm细胞球搏动幅度分别增加约15倍和6倍（图3a）。代表搏动偏转的矢量幅度增加了10倍以上（图3b）成纤维细胞接种比率也影响搏动率。ipsc-cm细胞球的搏动幅度随人成纤维细胞接种比例的增加而增加，但其搏动幅度随小鼠成纤维细胞的接种比例增加而降低（图3c和d，表1）。然而在不同的时间点，不同成纤维细胞的播种比例都会让ipsc-cm细胞球产生强烈的收缩，表明其收缩力对成纤维细胞本身的存在更为敏感，而不是精确的成纤维细胞接种比率。
图3 与成纤维细胞共培养可以显著调节ipsc-cm的固有收缩行为。(a)阻抗记录表示搏动幅度，ipsc-cm球(cm only)，小鼠胚胎成纤维细胞共培养球（cm-fb），原代人成纤维细胞共培养球(cm-hcfb)。(b)光学方法检测组装板中的搏动特性，发现成纤维细胞共培养对ipsc-cm搏动幅度有显著影响，(i,只有ipsc-cm; ii, mef共培养)。(c和d)增加人(i或空心正方形)或小鼠(ii或实心正方形)成纤维细胞比例对阻抗传感搏动幅度和速率的影响。
cm，ipsc-cm细胞球；cm_nano，含金-铁氧化物纳米颗粒的细胞球；cm_fb_nano，含金-铁氧化物纳米颗粒并与成纤维细胞共培养的细胞球。搏动特性以阻抗形式量化。
减少肌膜ca2+内流的电起搏揭示了肌力反应
正肌力药如异丙肾上腺素，通常引起ipsc-cm共培养球体出现变时性反应而不是变力性反应（图2a），可能反映了与肌膜相比，ipsc-cm共培养球体的肌浆网ca2+处理能力相对欠发达。通过调整台氏液中ca2+浓度减少肌膜ca2+内流，结合电起搏以控制搏动速率。在这些条件下，100 nm异丙肾上腺素使ipsc-cm共培养球体搏动幅度增大约两倍（图4a）。细胞外ca2+浓度滴定，从1.5 mm开始，表明在0.9 mm或更低的浓度时具有浓度依赖性，在0.6 mm更明显（图4b）。本研究未检查起搏的长期效应，但在0.9 mm ca2+没有异丙肾上腺素刺激的情况下，起搏20s后的zuihouyi次搏动较diyi次搏动幅度已经增加了1.24±0.8倍。在对照培养基或1.5mm 台氏液条件下，这种作用是不存在的（图4c），这证实了该机制与肌膜ca2+内流减少有关。尽管ipsc-cm共培养球体的应力-应变关系尚未量化，但鉴于共培养球体弹性系数（刚度）在急性实验期间保持不变，ipsc-cm共培养球体中的力产生（应力）可以由搏动幅度（应变）的相对变化来表示。与异丙肾上腺素相似，digaoxin（na+/k+atpase抑制剂）和xidinafei（5型磷酸二酯酶抑制剂）在基础条件下均未引起搏动幅度反应的增加。然而，在电起搏或者ca2+浓度降低的条件下，digaoxin引起明显的肌力反应（搏动幅度增加1.9±0.5倍），而xidinafei则无正性肌力作用（0.8±0.1倍）。这种情况可能由于digaoxin是一种非β-肾上腺素能机制的正性变力因子，而xidinafei在离体心肌细胞中是通过hcn（超极化激活环核苷酸门控通道）通道被激活起作用的。
图4 肌力反应受胞外ca2+浓度和电起搏调节。(a)在含0.6 mm ca2+的台式液和1 hz电起搏条件下，100 nm异丙肾上腺素能够使搏动幅度(肌力反应)增加。异丙肾上腺素添加前(实线)/后(虚线)。标准化之后搏动曲线宽度变小。(b)在同等搏动条件下对异丙肾上腺素刺激产生的肌力反应要求胞外ca2+水平低于1.2 mm。(c)含0.9 mm