主要用途
组织长链酮脂酰辅酶a硫解酶（ketoacyl coa thiolase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用酮脂酰辅酶a作为底物，在镁离子和辅酶a的激活下，底物解离后峰值的降低，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）长链酮脂酰辅酶a硫解酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β-氧化及最后经三羧酸循环被氧化生成co2和h2o，并释放能量等四个阶段。硫解酶（thiolase）存在于真核和原核生物的细胞里，分成两种类型：一种为酮脂酰辅酶a硫解酶（3-ketoacyl-coa thiolase；ec: 2.3.1.16），另一种为乙酰乙酰辅酶a硫解酶（acetoacetyl-coa thiolase；ec: 2.3.1.9）。酮脂酰辅酶a硫解酶又称为硫解酶i（thiolase i），以各种链长脂肪酸为底物，催化脂肪酸β-氧化的最终反应，释放乙酰辅酶a，同时产生短缺2个碳基的脂酰辅酶a。在真核生物中，酮脂酰辅酶a硫解酶又分为线粒体型和过氧化酶体型。长链酮脂酰辅酶a（例如酮十六脂酰辅酶a；3-ketohexadecanoyl-coa）在长链硫解酶i的催化下，发生镁-烯醇化物（mg-enolate）的裂解，致长链酮脂酰辅酶a底物的减少，在分光光度仪（303nm）下，吸光值降低，来定量分析长链酮脂酰辅酶a硫解酶的活性。长链酮脂酰辅酶a硫解酶反应系统为：
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入3毫升清理液（reagent a）清洗
4．（选择步骤）抽去清理液
5．移入到一个液氮冻存管
6．即刻放进液氮罐过夜
7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8．放进一个15毫升锥形离心管
9．加入置于冰槽里的500微升裂解液（reagent b）
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长303nm，间隔30秒，读数5次（共3分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化
3．缓冲液（reagent c）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1．移取800微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入50微升反应液（reagent d）
3．加入100微升底物液（reagent e）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育3分钟
6．加入50微升阴性液（reagent f）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－3分钟读数）
四、样品测定
1．移取800微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入50微升反应液（reagent d）
3．加入100微升底物液（reagent e）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育3分钟
6．加入50微升待测样品（10微克蛋白总量）（注意：样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－3分钟读数）
五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）x样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）x 13.5（毫摩尔吸光系数）x 3（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔酮脂酰辅酶a /分钟
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取200微升缓冲液（reagent c）到96孔板里
3．分别加入12.5微升反应液（reagent d）
4．分别加入25微升底物液（reagent e）
5．轻轻摇动96孔板
6．在25℃温度下孵育3分钟
7．分别加入12.5微升阴性液（reagent f）或待测样品（10微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
8．轻轻摇动96孔板
9．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和3分钟读数
10．活性计算：
[（样品读数－背景读数）x样品稀释倍数x 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.0125（样品容量；毫升）x 13.5（毫摩尔吸光系数）x 0.6（光径距离；厘米）x 3（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔酮脂酰辅酶a/分钟