中国仓鼠卵巢（cho）细胞，已成为治疗用蛋白类生物制品生产的主要细胞类型。随着瞬时转染技术(transient transfection)的进步，搭配cho细胞进行毫克至克级别蛋白的快速、高效生产，帮助推动药物研发阶段进程，允许更早的评估候选药物是否具备理想属性，从而投入更多资源生成稳定的克隆细胞系，用于后续药物的临床开发。
凭借20年在核酸递转领域的深耕细作，mirus推出了用于cho细胞蛋白/抗体生产的完整瞬转系统——chogro® high yield expression system。通过整合mirus转染技术及优化的cho培养基，相比于现有技术方案，可将蛋白表达量提升2-10倍。除此之外，该系统不含动物源性成分，致力于稳定的提高悬浮cho细胞的蛋白质产量。本文首先就影响cho细胞在蛋白表达实验中的关键影响因素进行讨论，包括转染试剂、培养基选择、增强子使用及培养温度优化；mirus chogro® high yield expression system体系，综合考虑上述影响cho蛋白表达的关键因素，并且将转染试剂、培养基及增强子进行优化、整合；最后，结合mirus chogro® high yield expression system针对不同蛋白/抗体类型的表达产量、体系放大以及细胞类型适配性数据，充分证明了mirus chogro® high yield expression system具备高产量、高稳定性、广泛的适配性以及操作灵活性等优势。
mirus chogro® high yield expression system（产品货号：mir 6270）中包括了以下组分：
产品名称
规格
单组分货号
transit-pro® 转染试剂
1 x 1 ml
mir 5740
chogro® titer enhancer
1 x 20 ml
mir 6220
chogro® expression medium
2 x 1 l
mir 6200
chogro® complex formation solution
1 x 100 ml
mir 6210
poloxamer 188, 10%
1 x 100 ml
mir 6230
l-glutamine, 200 mm
1 x 100 ml
mir 6240
cho细胞蛋白表达关键影响因素之转染试剂
chogro® high yield expression system系统中关键组分transit-pro®转染试剂，通过优化瞬时转染效率，可进一步提高目标蛋白/抗体产量。同样的，该转染试剂不含动物源成分，可以与悬浮cho或者293细胞搭配使用，并且可以兼容不同种类的培养基，旨在提高生产蛋白/抗体产量及稳定性。
测试使用chogro® high yield expression system系统中transit-pro®转染试剂（试剂:dna比例为1:1），在cho-s细胞瞬转表达gfp荧光蛋白。转染后48小时，分别使用流式细胞仪和荧光显微镜检测试剂转染效率和细胞活力。结果表明，单独使用transit-pro®转染试剂，可达到高水平的转染效率（图1）。
图1. 单独使用mirus chogro® high yield expression系统中的转染试剂（transit-pro® 转染试剂），也有着高水平的转染效率。
cho细胞蛋白表达实验关键影响因素之培养基
chogro® high yield expression system中的另一关键组分chogro® expression medium，也是提升cho细胞蛋白/抗体表达量的重要因素。细胞的生长状态、是否结团、细胞密度等都是评估cho细胞培养基的关键参数。
在细胞生长状态方面，转染freestyle™ cho-s细胞后，分别在chogro® expression medium和其他品牌培养基中进行培养。转染后六天，用chogro® high yield expression system中的chogro® expression medium培养的细胞结团数量明显少于其他品牌培养基（图2）。
图2. 使用mirus chogro® high yield expression system中的chogro® expression medium进行培养（左），细胞结块数量显著少于其他培养基培养的cho-s细胞（右）。
同样的，使用相同细胞系（freestyle™ cho-s）及细胞密度（0.5×106 cells/ml），平行比较mirus chogro® expression培养基及其他品牌培养基。实验结果显示，在mirus chogro® expression培养基中生长的细胞，有着更高的细胞密度，这也是提高cho细胞蛋白/抗体产量的重要前提。并且，在更高的细胞密度条件下，仍保持较高的细胞活性（图3）。
图3. 使用chogro® expression medium培养，cho细胞密度更高，并且保持着较高细胞活性。
cho细胞蛋白表达实验关键影响因素之增强子
使mirus研发团队针对不同应用或者细胞类型，开发出多种相适配增强子，例如针对cho细胞蛋白/抗体生产的增强子chogro® titer enhancer，也是包含在chogro® high yield expression system中的一个关键组分。其作用机制并非直接增加细胞的转染效率，而是通过调节细胞内特定的信号通路来增加cho细胞的蛋白表达滴度。平行实验分别对比了cho细胞对fc融合蛋白与igg的表达量，结果表明，与单独使用transit-pro® 转染试剂相比，加入chogro® titer enhancer后，cho细胞fc融合蛋白的产量有显著提升（图4）。此外，与pei转染体系相比，使用chogro系统的转染试剂和增强子，cho细胞igg的表达量可提高约3倍（图5）。
图4. 加入chogro® titer enhancer后，cho细胞fc融合蛋白的产量有显著提升
图5. transit -pro®转染试剂搭配chogro® titer enhancer，相较于pei转染体系，cho细胞igg的表达量可提高约3倍
cho细胞蛋白表达实验关键影响因素之培养温度
mirus chogro® high yield expression system除了通过培养基、转染试剂以及增强子三者的优化结合，在实验流程上也可以进行优化，从而进一步提高蛋白产量。根据科研或者不同应用需求，mirus chogro® high yield expression system有着多种灵活实验方案供选择：
方案一：mirus chogro® high yield expression system实验方案中所推荐的标准流程，即在转染当天加入chogro® titer enhancer，并立刻将细胞培养温度从37℃转移至32℃，转染后7-8天内收获蛋白，细胞活性仍可保持70%以上；
方案二：在方案一的基础上通过添加补料来延长细胞培养时间，保证细胞更长时间维持较高的密度和活率，将蛋白收获时间延长至7-11天；
方案三：转染后的细胞仍维持在37℃条件下培养，不加入补料，并在最短时间（4-5天）收获蛋白；
方案四：转染后的细胞仍维持在37℃条件下培养，通过在转染后18-24小时添加补料维持细胞密度和活率，将蛋白收获时间延长至4-7天。（有关添加细胞培养补料以维持细胞活率的建议，请参阅完整版实验方案）（图6）。
图6. chogro® high yield expression system的多种细胞培养方案
基于以上四种实验方案，分别测试了在转染后32℃和37℃培养条件下，以及是否添加补料对cho细胞igg产量的影响。实验使用chogro® high yield expression system，加入转染复合物及chogro® titer enhancer后，立即将cho细胞转移至32℃（左）或保持在37℃（右）。结果显示，转染后将细胞转移到32℃条件下培养，igg产量更高且细胞存活时间更长（图7）。
图7. 转染后将细胞转移到32℃条件下培养，igg产量更高且细胞存活时间更长
尽管mirus chogro® high yield expression system从cho细胞蛋白表达实验关键组分即转染试剂、培养基和增强子进行了优化整合，并提供了灵活的实验应用方案来提升cho细胞的蛋白产量，那么在实际生产过程中，该系统针对不同类型蛋白/抗体的产量、体系放大以及细胞类型适配性如何呢？
mirus chogro® high yield expression system针对不同类型蛋白/抗体的表达，有着更高产量
使用相同的细胞类型（freestyle™ cho-s cells）和质粒骨架，分别表达六种不同的治疗性抗体，比较测试了mirus chogro® high yield expression system和其他品牌表达系统。实验结果表明，在所有测试的六种抗体类型中，使用mirus chogro® high yield expression system的cho细胞表达的蛋白滴度更高，并且转染试剂用量更少，蛋白生产成本更低（图8）。
图8. 相比其他品牌cho转染表达系统，mirus chogro® high yield expression system有着更高的蛋白产量
chogro® high yield expression system生产规模的可扩展性
通过对6孔板（细胞培养体积2ml）至5l摇瓶（细胞培养体积2l）等不同培养体积进行转染，对chogro® high yield expression system生产规模的可扩展性进行评估，实验结果表明，从最小反应体系（6孔板）至最大反应体系（5l摇瓶），生产体系放大了1000倍，都有着近似的蛋白滴度，意味着chogro® high yield expression system可以整合到不同cho细胞蛋白/抗体研究和生产工作流中（图9）。
图9. mirus chogro® high yield expression system的生产体系扩大1000倍，依然保持着近似的蛋白产量。
chogro® high yield expression system不同cho细胞适配性
选择两种常用于蛋白/抗体生产的cho悬浮细胞cho-s和expichotm，评估chogro® high yield expression system对不同cho细胞类型的适配性。实验结果表明，chogro® high yield expression system可适配多种cho细胞类型，在不同cho细胞中的蛋白表达也有着近似的产量（图10）。
图10. mirus chogro® high yield expression system可适配不同cho细胞类型
综合上述，通过上述mirus chogro® high yield expression system的测评数据，表明了该系统具有以下特点及优势：
更高的蛋白产量：可将cho细胞瞬转的蛋白表达量提升2-10倍
可稳定放大生产体系：将转染体系放大1000倍，其蛋白表达量依然保持稳定
适配不同类型cho细胞：搭配不同类型cho细胞也可得到近似蛋白产量
如何查找或选择适合的转染试剂？
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mirus产品年鉴
美国mirus公司成立于1995年，是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司，同时也是该类试剂的主要供应商之一。其产品线涵盖化学转染试剂、电转染产品、病毒生产和转导产品，适用于基因功能研究、蛋白生产、病毒载体生产和动物模型构建等领域。
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