硝酸还原酶（nitrate reductase，nr）活性测定试剂盒说明书
微量法100管/96样
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
nr（ec 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：
nr催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，no3ˉ +nadh+h＋→ no2ˉ +nad＋+h 2o；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
诱导剂储备液：液体50ml×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60ml×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10ml×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体5ml×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体6ml×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；
试剂四：液体6ml×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1ml，-20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10ml诱导剂储备液加90ml蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/ml的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9ml蒸馏水，充分混匀。
样本前处理：
动植物组织样品的前处理:
（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注意：
1、建议使用新鲜没有冷冻过的样本。
2、一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（a测定≤a对照管）则需要诱导处理。
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在ep管或96孔板中加入下列试剂）
试剂名称（μl）
加样孔
测定管
对照管
标准管
空白管
样本
20
20
0.1μmol/ml标准液
20
蒸馏水
75
95
试剂一
75
75
试剂二
25
25
25
25
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）反应30min
试剂三
50
50
50
50
试剂四
50
50
50
50
混匀，25℃室温显色20min，540nm处比色
注意：1、标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。
2、诱导处理后的样本对照管中试剂二改成加25μl蒸馏水。
nr活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生1μmol no2ˉ的量为一个nr活力单位。
nr（μmol/h/g 鲜重）= (c标准管×v1)×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷(w×v1÷v2)÷t=0.2×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷w
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol no2ˉ的量为一个nr活力单位。
nr（μmol/h/mg prot）=(c标准管×v1)×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷(v1×cpr)÷t=0.2×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷cpr
c标准管：标准管浓度，0.1μmol/ml；v1：加入样本体积：0.02ml；v2：加入提取液体积，1ml；t：反应时间，0.5h；cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；w：样本鲜重，g。