酶的底物
　hrp的底物
hrp催化过氧化物的氧化反应，最ju代表性的过氧化物为h2o2，其反应式如下：
dh2+ h2o2 d+ h2o
上式中，dh2为供氧体，h2o2为受氢体。在elisa中，dh2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(o-phenylenediamine, opd)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, tmb)和abts[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
opd氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是hrp结合物最chang用的底物。opd本身难溶于水，opd•2hcl为水溶性。曾有报道opd有致异变性，操作时应予注意。opd见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，opd和h2o2一般分成二组分，opd可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的elisa试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% h2o2的应用液,只需加入opd后即可作为底物应用液。
tmb经hrp作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。tmb性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与h2o2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，tmb又有无致癌性等优点，因此在elisa中应用日趋广泛。酶反应用hcl或h2so4终止后，tmb产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
abts虽不如opd和tmb敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种hrp的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,hppa]，经hrp作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于elisa的优点为可加宽定量测定的线性范围。
hrp对氢受体的专一性很高，仅作用于h2o2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。h2o2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较h2o2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。
ap的底物
ap为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-npp)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用naoh终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
ap也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于elisa作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
　酶反应终止液
常用的hrp反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式elisa中一般采用2mol/l。