本法是目前elisa试剂盒酶标记抗体较好的方法，能使70%酶与90%以上球蛋白结合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，fdnb）封闭hrp表面的游离氨基（亦可用甲醛或戊二醛来封闭），从而提高酶结合抗体球蛋白的能力，避免酶的自身交联。然后用过碘酸钠来氧化hrp表面结构的醣链部份（即低聚醣基团）使成醛基，使其直接与抗体球蛋白上的游离氨基形成共价键而结合。zui后用硼氢酸钠还原，使hrp表面醛基能充分与抗体球蛋白上氨基进行反应，使之形成稳定的结合物。其反应式如下:
nh2 n=ch2
（1） fe—e +hcho----> fe—e +h2o
ch2oh ch2oh
n=ch2 naio4 n=ch2
（2） fe—e +o---->fe— e + h2o
ch2oh cho
n=ch2 n= ch2
（3） fe—e +h2n-ig---> fe—e + h2o
cho c=n-ig
h
elisa试剂盒标记步骤是：10mg hrp溶于新鲜配制的0.3 mol/l ph 8.1*2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯无水乙醇溶液，室温中搅拌1小时以封闭hrp表面的游离氨基。再加2ml 0.08 mol/l naio4水溶液，于室温中轻搅30分钟，用0.16 mol/l乙二醇溶液终止氧化反应。1小时后移入透析袋中置0.01 mol/l ph 9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，除去试剂，透析袋中的即为醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗体球蛋白（用2ml碳酸盐缓冲液溶解），混匀，室温搅拌2-3小时后加10mg硼氢酸钠盐，4℃冰箱4小时或过夜。次日取出加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物（去游离酶），并用50%饱和硫酸铵洗涤1-2次。再溶于3ml ph 7.4 pbs中，并置透析袋经透析除盐，如有沉淀藉离心除去。上清酶结合物加入等量60%甘油pbs，分装保存，冰箱备用。
如采用改良过碘酸钠简化法制备酶结合物，比原法更简便、快速，所获制品质量良好。其方法是取10mg hrp加1ml0.1 mol/l醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08 mol/l naio4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4 mol/l乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21% nacl溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇（ar）沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇（尽量去除乙醇），沉淀用ph9.6的0.05 mol/l碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊或马抗人igg（内含蛋白量20mg左右），搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg nabh4 混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50%饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01 mol/l pbs 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐（需换液5次），如有沉淀藉离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60%甘油pbs，分装保存备用。
制备好的酶结合物，要作两者克分子比和使用稀释度的测定，标记率的测定（a403/a280—0.4—1.0为宜）。
1、酶结合物克分子比测定：将制备好的酶结合物经适当稀释在分光光度计中以280nm和403nm测o.d值，然后按下列公式计算两者的克分子比。
（1）酶戊二醛交联法的计算：
酶量：mg/ml=o.d403nm×0.4,其中0.4为酶o.d403nm=1.0时相当于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（o.d280nm-o.d403nm×0.42）×0.94×0.62
其中o.d403nm×0.42为酶蛋白结合戊二醛后在280nm应有的o.d，抗体球蛋白0.62为蛋白质与酶--戊二醛结合后o.d280nm值约应以加6%，故以0.94校正之。换算系数，故zui后要乘于0.62。
（2）elisa试剂盒用过碘酸纳氧化法的计算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（o.d280nm-o.d403nm×0.3）×0.62
其中o.d403nm×0.3为酶蛋白本身在280nm应有的o.d值。
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶结合物的克分子比。