中华人民共和国国家标准
gb/t 36858-2018
饲料中黄曲霉毒素b1的测定
高效液相色谱法
determination of aflatoxin b1 in feeds-
high performance liquid chromatography
警示——黄曲霉毒素b1是高致癌物质，应小心处理，分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进行。分析过程中，操作者应采取相应的防护措施。分析过程结束后，接触过的器皿及黄曲霉毒素b1溶液应使用浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡过夜。
1范围
本标准规定了测定饲料中黄曲霉毒素b1的高效液相色谱法。
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中黄曲霉毒素b1的测定。
本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为2.0μg/kg。
2规范性引用文件
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gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 14699.1饲料采祥
gb/t 20295动物饲料试样的制备
3原理
试样中的黄曲霉毒素b1经黄曲霉毒素b1提取溶液提取后，再经三氯甲烷萃取、三氟乙酸衍生，衍生后的黄曲霉毒素b1采用反相高效液相色谱-荧光检测器进行测定，外标法定量。
4试剂或材料
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。
4.1水：符合gb/t 6682中规定的一级用水。
4.2甲醇：色谱级。
4.3乙腈：色谱级。
4.4三氯甲烷。
4.5黄曲霉毒素b1提取溶液：量取84 ml乙腈，加入到16 ml水中，混匀。
4.6黄曲霉毒素b1衍生溶液：分别量取20 ml三氟乙酸，加入70 ml水中，混匀后加入10 ml冰乙酸，混匀。临用现配。
4.7流动相：分别量取20ml甲醇、10ml乙腈和70ml水，混匀。经0.22μm有机滤膜过滤后备用。
4.8黄曲霉毒素b1标准储备溶液（1000μg/ml）：精确称取黄曲霉毒素b1对照品（纯度≥98%）10.0 mg，用10 ml乙腈完全溶解，配制成黄曲霉毒素b1含量为1 000μg/ ml的标准储备溶液，-20℃保存，有效期为6个月。或有证标准溶液。
4.9黄曲霉毒素b1标准工作溶液：取1.0 ml黄曲霉毒素b1标准储备溶液，用乙腈定容至100 ml，浓度为10μg/ml。再取此稀释液1.0 ml，用乙腈定容至100 ml，则浓度稀释为100 ng/ml的标准工作溶液。
4.10黄曲霉毒素b1标准系列溶液：将黄曲霉毒素b1标准工作溶液用乙睛分别稀释成1 ng/ml、
2 ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的标准系列溶液。临用现配。
4.11有机滤膜：直径50mm，孔径0.22μm。
4.12针头式过滤器：有机型，孔径0.22μm。
4.13乙腈水溶液（90+10）：量取90 ml乙腈，加入到10 ml水中，混匀。
5仪器设备
5.1高效液相色谱仪：配备荧光检测器。
5.2分析天平：感量为0.01 mg。
5.3溶剂过滤器：规格1 000 ml。
5.4氮吹仪。
5.5恒温振荡器。
5.6旋涡混合仪。
5.7超声波清洗仪。
5.8水浴锅。
6样品
按gb/t 14699.1规定采集有代表性的试样，按照gb/t 20195规定将试样粉碎，过0.42 mm分析筛，混匀后装入密闭容器中，备用。
7试验步骤
7.1试样处理
平行做两份试验。称取5.00 g（精确到0.01 g）试样置于100 ml带塞锥形瓶中，加入25.0 ml黄曲霉毒素b1提取溶液（4.5），室温下200 r/min振荡提取60 min，用中速滤纸过滤，取10.0 ml滤液于50 ml具塞离心管中，加入10.0 ml三氯甲烷（4.4）萃取，旋涡混合1 min，静置分层后，取下层萃取液于15 ml具塞离心管中，50℃水浴氮气吹干。加入200μl乙腈水溶液（4.13）复溶，然后加入700μl黄曲霉毒素b1衍生溶液（4.6），加塞混匀，40℃下恒温水浴街生反应75 min后，经0.22μm微孔滤膜过滤后，待测。
7.2标准系列
分别取0.9 ml黄曲霉毒素b1标准系列溶液（4.10）于7个10 ml具塞离心管中，50℃水浴氮气吹干，用200μl乙腈水溶液（4.13）复溶，然后加700μl黄曲霉毒素b1衍生溶液（4.6），加塞混匀，40℃下恒温水浴術生反应75 min，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，待测。
7.3高效液相色谱参考条件
色谱柱：c18色谱柱，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5μm；或性能相当者。
流动相（4.7）。
流速：1 ml/min。
激发波长：365 nm；发射波长：440 nm。
柱温：30℃。
进样体积：20μl。
7.4测定
在上述液相色谱参考条件下，将衍生后的黄曲霉毒素b1标准系列溶液、试样溶液注入高效液相色谱仪，测定相应的响应值（峰面积），采用单点或多点校正，外标法定量。黄曲霉毒素b1标准溶液色谱图参见附录a。
8试验数据处理
试样中黄曲霉毒素b1的含量以质量分数ω表示，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1）计算：
式中：
ρ——试样衍生液在标准曲线上对应的黄曲霉毒素b1含量，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v1——提取液的总体积，单位为毫升（ml）；
v2——用于萃取的提取液体积，单位为毫升（ml）；
m——试样的质量，单位为克（g）；
0.9——衍生后的试样溶液体积，单位为毫升（ml）。
以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留至小数点后一位。
9精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，不大于该平均值的20%。