体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis,se）可以不经过配子融合，由体细胞分化发育成整个植株。se是一个多因素的发育过程，也是研究细胞全能性的理想模型。目前，se在多个领域得到了应用，例如：种质保护、人工种子生产、单倍体育种、无性繁殖，以及作为植物生物技术研究领域的平台工具。然而，目前对se调控机制的理解仅限于少数模式植物（例如：拟南芥），而且不同物种之间se调控机制存在很大差异。因此，深入研究重要经济作物棉花的se调控机制对棉花育种和繁殖具有重要的意义。
2023年7月11日，郑州大学与中棉所棉花生物学国家重点实验室的研究成果发表在new phytologist（if=9.4，q1区）期刊上，题目为“ghrcd1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18 transcriptional cascade”。该研究使用dna亲和纯化测序(dap-seq)技术鉴定了陆地棉ghmyc3的结合基序和靶基因。揭示了ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18转录级联调控棉花se的分子机制，为细胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。
1.ghmyc3是棉花se过程中一个重要的调控因子
通过序列比对和系统发育分析，在陆地棉中筛选到一个与homo-myc具有高度系统发育相似性的同源基因ghmyc3，具有1个bhlh和1个bhlh-myc_n结构域。于是假设ghmyc3在决定细胞命运方面具有与人类myc相似的生理功能。
为研究ghmyc3对se过程中细胞命运转变的影响，构建了过表达ghmyc3的棉花转基因系（oe-ghmyc3）。表型分析发现过表达ghmyc3显著诱导了se，促进愈伤组织生长。随后，ghmyc3的rnai细胞系（ri-myc3）表型分析发现ri-ghmyc3与wt的愈伤组织形成率一致，但新鲜愈伤组织的重量（fw）略轻，胚性愈伤组织（ec）分化率显著降低。以上结果表明，ghmyc3促进棉花体细胞向愈伤组织的去分化，但阻止了向ec的转变过程。
ghmyc3调控棉花se过程
(a)智人、陆地棉、拟南芥中myc蛋白的系统发育分析。(b)棉花se过程示意图。下胚轴作为外植体，用愈伤组织诱导培养基培养，体细胞去分化形成愈伤组织，在60-90天的生长过程中，增殖的愈伤组织重新分化为ec，ec发育成体细胞胚，而后在体细胞胚诱导培养基上萌发为幼苗。(c) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3在ec分化过程中的形态差异。(d)长日照下生长的wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3植株叶片组织中ghmyc3的相对表达量。(e) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3愈伤组织的fw。(f) wt、oe-ghmyc3、ri-ghmyc3的ec分化率。
2.ghmyc3直接与ghmyb44和ghlbd18的启动子结合，调控其表达
dap-seq分析鉴定了ghmyc3的dna结合基序及其下游靶基因。鉴于愈伤组织形成和根系生长具有共同的调控途径，作者鉴定到了与根系发育和生长素信号通路有关的2个靶基因ghmyb44和ghlbd18。亚细胞定位分析发现ghmyc3、ghmyb44和ghlbd18主要表达于细胞核。在ghmyb44和ghlbd18的启动子中存在与ghmyc3结合的g-box（cacgtt）元件。酵母单杂交（y1h）和电泳迁移率（emsa）实验验证了ghmyc3特异性地结合ghmyb44和ghlbd18启动子中的g-box基序。另外，烟草叶片瞬时表达分析发现ghmyc3以g-box依赖的方式激活ghlbd18的转录，抑制ghmyb44的转录。
ghmyc3直接结合并调控ghmyb44和ghlbd18的转录
(a) ghmyc3的结合序列在基因组上的分布。(b) ghmyc3的主要结合基序ca t/c gt t/g。(c) ghmyc3下游基因的go富集分析。(d)ghmyb44和ghlbd18启动子序列中包含g-box基序。(e) y1h实验。(f) emsa实验。(g-h)烟草叶片瞬时表达分析及luc荧光强度统计。
3.ghmyb44与ghlbd18的启动子直接相互作用，抑制其表达
dap-seq分析发现在ghlbd18启动子中存在myb转录因子结合位点。y1h和emsa实验验证了ghmyb44与ghlbd18启动子的直接结合。瞬时基因表达分析表明ghmyb44通过直接结合ghlbd18的启动子序列抑制其表达。以上结果表明，ghmyc3除了通过与ghlbd18启动子特定位点结合直接激活ghlbd18的表达外，还通过ghmyb44-ghlbd18转录级联信号间接调控ghlbd18的表达。
4.ghmyb44通过ghlbd18调控se过程
利用oe-ghmyb44、srdx-ghmyb44（特异性沉默系）和oeghlbd18棉花株系进一步研究myb44调控se的过程。与wt相比，在oe-ghmyb44中愈伤组织起始延缓，愈伤组织增殖减弱，ec分化加速；相反，在srdx-ghmyb44和oe-ghlbd18中愈伤组织起始提前，愈伤组织增殖增强，ec分化延迟。因此，ghmyb44在ghlbd18的上游发挥作用，在愈伤组织起始、愈伤细胞增殖和愈伤组织向ec的转变过程中控制细胞命运的决定。
5.ghrcd1与ghmyc3相互作用调节se过程
采用酵母双杂交（y2h）鉴定到在se过程中与ghmyc3互作的蛋白ghrcd1，该蛋白在愈伤组织和ec形成的不同阶段均被诱导，但在体细胞胚中保持较低水平。双分子荧光互补（bifc）实验、pull down实验、luc互补实验证明了ghmyc3与ghrcd1蛋白有相互作用。ghrcd1的敲除突变体（ko-ghrcd1）和过表达转基因系（oe-ghrcd1）实验分析发现，与wt相比ko-ghrcd1表现出愈伤组织起始提早，生长加快，fw增加；而与wt和ko-ghrcd1相比，oe-ghrcd1表现为愈伤组织起始延迟，增殖减少，ec分化率降低。结果表明，rcd1的适当表达对se过程至关重要，但rcd1的过表达或突变均不利于愈伤组织细胞的命运转变过程。
ghrcd1与ghmyc3有相互作用
(a)y2h实验。(b) bifc实验。(c) pull down实验。(d) luc互补实验。(e-g)ko-ghrcd1和oe-ghrcd1在se不同发育阶段的形态学分析(e)、fw分析(f)和ec分化率分析(g)。
6.ghrcd1拮抗ghmyc3调控下游靶基因的转录能力
使用双荧光素酶报告（dual-luc）实验检测ghrcd1是否影响ghmyc3对其下游靶点的转录调控。将luc报告基因分别与ghmyb44和ghlbd18启动子融合，再通过瞬时转染测定启动子活性。ghmyc3的过表达抑制了ghmyb44启动子驱动的luc表达，但过表达ghrcd1削弱了这种抑制作用；ghmyc3增强了ghlbd18启动子驱动的luc表达，而过表达ghrcd1削弱了这种增强作用。此外，ghmyb44能够直接抑制ghlbd18的表达，但ghmyb44和ghmyc3共表达导致ghlbd18启动子驱动的luc表达水平显著高于单独表达ghmyb44，这表明ghmyc3直接干扰了ghmyb44对ghlbd18的转录调控。qrt-pcr检测结果表明ghmyb44的表达水平与ghmyc3的表达呈负相关。ghlbd18在oe-ghmyc3和srdx-ghmyb44中表达上调，而在ri-ghmyc3细胞系中表达下调。总之，在se过程中ghrcd1抑制ghmyc3对ghmyb44和ghlbd18的表达调控能力。
7.由rcd1-myc3-myb44-lbd18级联介导的活性氧稳态调节细胞命运转变
利用ros荧光探针h2dcf和bcip-nbt检测se不同发育阶段的ros积累，发现ros最初在外植体阶段的损伤组织中增加，细胞内ros水平与愈伤组织细胞增殖呈正相关，第21 d时在发育的愈伤组织中观察到氧化爆发。在ec发育过程中，ros在愈伤组织的胚性前区富集，但在其他部位枯竭。过表达ghmyc3和ghlbd18导致ros积累，促进愈伤组织细胞增殖，然而过表达ghmyb44则相反。最后，该研究提出了一个愈伤组织形成和se的模型。在下胚轴外植体培养的不同发育阶段，ghrcd1、ghmyc3、ghmyb44和ghlbd18的表达水平与细胞命运决定和细胞分化动态紧密相关。这些基因的精确时空表达可调节细胞内ros的积累，进而影响se过程中的细胞命运转变。
ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18信号级联调控se的机制模型图
在愈伤组织诱导过程中，ghmyc3通过调控ghmyb44和ghlbd18的转录，进一步激活ros依赖的信号通路，使ros优先在诱导部位积累，并在愈伤组织增殖过程中达到峰值。在ec获得过程中，较高水平的ghrcd1可能抑制ghmyc3对ghmyb44和ghlbd18的转录调控，从而相应地减少ros的积累，而且ros在ec周围呈极性分布。
本文小结：该研究揭示了se过程中细胞命运转变的调控网络。ghmyc3通过结合ghmyb44和ghlbd18启动子中的g-box元件调节其表达。ghrcd1拮抗ghmyc3对下游靶基因的转录调控能力。ghrcd1-ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18组成的转录级联模块呈现时序表达模式，并时序性的调节细胞内ros稳态，进而影响se过程中细胞的命运。
参考文献：yuan j, liu x, zhao h, wang y, wei x, wang p, zhan j, liu l, li f, ge x. ghrcd1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the ghmyc3-ghmyb44-ghlbd18 transcriptional cascade. new phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120.(if=10.323)
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