建立了液相色谱检测水体中微囊藻毒素（microcystins,mcs）的方法。选择xad2树脂为富集树脂，采用四氯化碳10%乙醇10%丙酮连续淋洗，获得较好的杂质去除效果，采用90%甲醇可以将树脂柱上的mcs*洗脱。hplc采用v（0.1%tfa）：v（甲醇）=42∶58混合溶液为流动相进行等度洗脱，mcrr和mclr取得较好分离效果,回收率均达到90%以上。水样富集2000倍后，方法的检出限为0.05μg/l。本方法操作简便、灵敏度高、检测速度快。
【关键词】微囊藻毒素;液相色谱
1引言
随着工农业的迅速发展以及污水排放量的增加,水体富养化日益严重,频繁暴发蓝藻水华，微囊藻毒素是在蓝藻水华污染中出现频率zui高、产量zui大、造成危害zui严重的藻毒素。zui常见的有微囊藻毒素rr（microcystinsrr,mcrr）和微囊藻毒素lr（microcystinslr,mclr）。mcs具有明显的肝毒性，会导致肝癌的发生。
目前，检测水体中mcs的常用方法有hplcuv法[1,3,5]和lcms法[2,4,6～8]。其中质谱法检出限低,测定结果准确,但是价格昂贵。由于天然水体中mcs的含量低，因此在进样检测之前需要对其进行富集，文献中主要采用固相萃取柱（spe）[2～5,8]和免疫亲和层析柱（iac）[1]进行富集，但是这些柱子成本过高，且不能重复使用。本研究采用xad2大孔吸附树脂富集mcs,成本低，且树脂经活化后可以重复使用。
本研究以mclr和mcrr为对象，对色谱检测条件以及水样前处理过程中使用的富集柱、淋洗液和洗脱液进行了选择，建立并且优化了xad2树脂富集hplcuv检测水体中的微囊藻毒素的方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
l7110型液相色谱仪（日本日立公司）;浙江大学n2000色谱工作站（浙江大学智达公司）;xad2树脂（sigmaamberlite公司）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;超纯水机（美国millipore公司）;0.45μm混合纤维素酯微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。mcrr和、mclr标准品（alexis公司）;甲醇和三氟乙酸均为分析纯。藻粉：北京市玉渊潭公园的水华蓝藻经干燥、粉碎制得。
2.2色谱条件
inerteilods3色谱柱（416mm×250mm,5μm）;柱温25℃,流动相：v（0.1%tfa）∶v（甲醇）=42∶58，流速：1ml/min,进样量：20μl,检测波长为239nm。
2.3mcrr、mclr标准曲线的绘制
取mcrr和mclr的标准品分别配成浓度梯度为5.0，10.0，20.0和25.0mg/l的标准溶液，在上述色谱条件下用hplc进行检测，以峰面积y对标准品浓度x（mg/l）绘制标准曲线。
2.4样品前处理
2.4.1xad2树脂的预处理取40gxad2树脂，采用湿法装柱，柱床高约45cm，装柱后依次用甲醇和水清洗，除去杂质，赶走可能吸附于树脂上的空气泡，备用。
2.4.2微囊藻毒素的富集与净化取2l水样，用滤纸过滤后，通过富集柱进行富集，依次用90ml四氯化碳、90ml10%乙醇和90ml10%丙酮连续淋洗，去除杂质后，用150ml90%甲醇溶液洗脱。将洗脱液旋转蒸发后用氮气吹至体积小于1ml，用纯甲醇定容至1ml，过0.45μm滤膜，以hplc检测。若不及时进样,将样品密封,置-20℃冰箱内保存。
3结果与讨论
3.1色谱分析条件的优化
以甲醇tfa水体系作为流动相并进行等度洗脱,实验成本低，实验后色谱柱容易清洗，对实验人员的危害小。考察了流动相中0.1%tfa与甲醇的体积比（30∶70,40∶60,48∶52和50∶50）对分离的影响。结果表明,v（0.1%tfa）∶v（甲醇）=30∶70和40∶60，mcrr和mclr的保留时间短,但在mcrr出峰处有干扰;v（0.1%tfa）∶v（甲醇）=50∶50,干扰不明显,但在35～40min内出峰才能完成。v（0.1%tfa）∶v（甲醇）=48∶52，在25min内完成出峰，避开了mcrr出峰处的干扰。图1藻毒素的容量因子随甲醇比例的变化趋势
将计算所得的mcs的容量因子对甲醇的浓度作图（图1）。从图1可以看出，mclr比mcrr的容量因子大，柱子对前者吸附能力较强。藻毒素的容量因子受流动相中甲醇比例的影响，随着甲醇比例的增加，两种mcs的容量因子变小，并且mclr较mcrr变化得更快。
3.2洗脱液的选择
根据文献报道以及实验结果中mcs的回收率和色谱峰的干扰情况，采用90%甲醇作为洗脱液。
将藻粉用50%甲醇反复冻溶、进行超声提取，得到藻毒素提取液，加水配制成20.6和7.1μg/l的模拟水样。将水样过xad2树脂柱富集，用90%甲醇洗脱，每流出10ml洗脱液作为一个样品，图2mcrr和mclr的洗脱曲线
fig.2elutioncurvesofmicrocystinsrr（mcrr）andmicrocystinslr（mclr）连续收集，依次编号。将样品浓缩至1ml,用hplc检测每个样品中mcs的含量，绘制mcrr和mclr的洗脱曲线（图2）。由图2可见,90ml洗脱液即可*洗脱mcrr和mclr。考虑到实际水样中含有的mcs可能高于模拟水样，本实验采用150ml90%甲醇作为洗脱液。
3.3淋洗液的选择
xad2树脂富集柱在洗脱前用适当的淋洗液进行淋洗,可以减少杂质及其对分析的干扰。使用未检出mcs的天然水样添加蓝藻提取液配制成mcrr和mclr分别为20.6和7.1μg/l的模拟水样。此模拟水样富集后，尝试以四氯化碳、10%乙醇、10%丙酮、10%乙酸、正己烷和正丁醇作为淋洗液，再用90%甲醇洗脱mcs，杂质淋洗液和mcs的洗脱液分别进样分析，对比不同淋洗液的淋洗效果。谱图分析发现，正己烷和正丁醇对杂质几乎没有洗脱效果。乙酸对杂质洗脱效果明显，但是同时会洗下较多的藻毒素。综合考虑淋洗杂质及回收率素，本实验采用ccl410%乙醇10%丙酮进行梯度淋洗,其杂质淋洗效果见图3。在上述前处理以及色谱条件下，得出微囊藻毒素的典型色谱图如图4。
3.5标准曲线、回收率、精密度及检出限
mcrr的标准曲线为：y=24263x-18094，r=0.9997;mclr的标准曲线为：y=22190x-19309，r=0.9999。两者的线性范围均为5.0～25.0mg/l。在信噪比（s/n）为3时,检出限可达0.1mg/l。将藻毒素提取液加入未检出微囊藻毒素的天然水体，配制成3种浓度的模拟水样：高浓度：41.2μg/lmcrr,14.2μg/lmclr;中浓度：13.7μg/lmcrr,4.73μg/lmclr;低浓度:4.12μg/lmcrr,1.42μg/lmclr。采用优化后条件分别对3种浓度的水样进行重复测定5次。结果显示：3种浓度下mcrr和mclr的回收率均大于90%，相对标准偏差小于均1.4%，说明本方法具有较好的重现性。在信噪信噪比（s/n）为3，富集倍数为2000时，水体中两者的检出限均为0.05μg/l。