奥林巴斯体视显微镜——电镜方法中的冷冻技术
在常规奥林巴斯体视显微镜的电镜方法中，样品需要脱水，所脱掉的水份平均约占组织重量的三分之二；从取材到镜下观察，样品还要经过一系列的化学与物理因素的处理。上述任何一个因素都可能使生物样品的成份和超微结构发生变化，从而造成人工假象。为此，建立了冷冻技术（ctyr航eehniq此s）。冷冻技术不仅能解决某些常规方法不可避免的问题，揭示常规方法无法看到的一些结构细节，而且所得结果也可与常规方法的结果进行比较，检验后者的客观真实性。
奥林巴斯体视显微镜的各种冷冻技术面临的一个共同问题是避免产生冰晶、特别是大的冰晶。这些冰晶一旦产生，将会使细胞结构严重破坏。因此，要设法在冷冻过程中只产生很小的冰晶，如果可能，不产生冰晶，即使组织中的水份处在“玻璃态”。为了达到这一目的，目前采取的措施有两个：（1）速踪。单纯使用速冻时，为了不产生冰品，组织的冷冻速度应达到一100℃／（s·c航）或更快；（2）使用冷冻保护剂。使用保护剂后，组织的冷冻速度可降至10—lo09c。而不致产生大的冰晶。
本章为奥林巴斯体视显微镜的电镜方法中常用的几种冷冻技术作一简要介绍。冷冻断裂与冷冻蚀刻样品经冷冻后，在真空中断裂，并制备裂面的复型，用于奥林巴斯体视显微镜的电镜观察的方法称为冷陈断裂。如果在制备复型前，先加温样品，使裂面上的冰部份升华，则称为冷陈蚀刻。这两种方法的共同特点是可以在复型膜上观察理面的立体形象，此外，奥林巴斯体视显微镜的冷冻蚀到还可以揭示细胞膜内外表面的：：维结构。
在奥林巴斯体视显微镜的透射电镜下，从复型膜上看到的裂面不外两类：一是垂直于膜断裂的，其结构与超薄切片所显示的类似，因而不难辨认。另一类是平行于膜裂开的。由于样品迅速冷冻，膜的胎双层疏水区结合力较弱．生物膜常沿此区断裂，从而暴露出膜的内部结构。因此．这种方法是研究生物膜结构的重要手段。
需要待别提出的是样品在用奥林巴斯体视显微镜冷冻前应经冷冻保护剂的预处理。常用的冷冻保护剂有甘油、蔗糖、二甲基亚矾（dmso）等，其中以甘油为zui常用。所用甘油浓度随所研究的组织的含水量而有不同，一般为20％一40％。合水量多的组织，甘油浓度应较大。在甘油内浸泡的时间伸缩性很大．有时需要过夜。由于很多生物膜不能耐受甘油的长时间浸泡，因此于浸泡前常需用戊二醛固定，以上过程均在冰箱内进行。下面是具体作法：
冷冻保护剂浸渍
奥林巴斯体视显微镜的固定后的组织块，经o．1咖1儿磷酸缓冲姬．复洗涤时．再转入合适当浓度甘油6t生理盐水中。数组织，皆油浓度可在25％一30％，浸渍时间至少要20分5基本要求是组织块内外在极短的时间内（o．1一o．2秒）达到冷冻，为达此目的，除了组织块要小（1×1×3mm）以外．所用的冷冻剂应当具备热容量大、导热快，沸点高的特点。液氯具备前两个特点，但沸点较低。
因此，如果奥林巴斯体视显微镜将组织块直接浸入液氮，由于液氦的气化，在组织块表面将形成一个由氮气构成的绝热层、阻碍组织块内热量的迅速散失，从而使冷冻速度下降。为解决这一问题，目前奥林巴斯体视显微镜一般的作法是先将组织块在沸点较高的氟里昂内冷冻，然后再转入液氮。是冷冻的具体步骤。先将经过预处理的组织块嵌入样品杯内。佯品杯是一个中心有小孔的饲块。样品嵌入小孔，并突出小孔外约1mm，以便切断。如果所研究的是悬浮细胞，可将经离心浓缩后的细胞悬液滴于小孔内，并在小孔中插入一小塑料管，使塑料管突出小孔外一部份。第二步，将带有样品的样品杯浸入氟里昂内冷冻。盛有氟里昂的金属容器安置于一个更大的容器内，其中装有液氦。液氮的液面不要过高，以免氟里昂冻结。
zui后，用一经液氮预冷的镊子将冷冻后的样品连同样品杯一起转入液氮。在此之前应将多余的氟里昂迅速从样品杯上吸去。
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