一、mtt是什么
mtt是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
二、mtt法用来做什么
简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。mtt主要有两个用途
1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何mtt可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（dmso）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（od值），来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料
1．mtt溶液的配制通常mtt配成的终浓度为5mg/ml,须用pbs或生理盐水做溶剂。市面上一般mtt的包装为100mg,250mg或1g
1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将mtt放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlpbs来溶解。具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20mlpbs，从中先吸取500-1000ulpbs装入含mtt的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的mtt不残留于管内。将mtt*混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可*保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在ep管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：
1.在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住。配成的mtt需要无菌，mtt对菌很敏感
mtt一般现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的mtt溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度*保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当mtt变为灰绿色时就不能再用。
mtt有致癌性，用的时候小心,有条件带那种透明的簿膜手套.
2．mtt甲瓒溶解液
2.1二甲基亚砜dmso，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2三联溶解液：sds10g，异丁醇5ml，10mhcl0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
该溶解液因含有sds，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将sds结晶全部溶解后再使用。
五、mtt法实验步骤
1.*消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的625px2为例，
1)细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。
2)另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.
3)从*步准备的3ml细胞悬液中取1ml,加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。
4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌pbs填充）。
注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间*相同，这对于mtt的结果至关重要。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真shi情况。下图可做为96孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在ep管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4. 5%co2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），继续培养4h。若药物与mtt能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用pbs冲2-3遍后，再加入含mtt的培养液。
6.终止培养，准备溶解结晶。
溶解结晶的方法有两种，*种，用dmso溶解
1)mtt加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。
2)每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。
另一种方法，用三联溶解液（见上面mtt甲瓒溶解液）
1)mtt加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有sds，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将sds结晶全部溶解后再使用。）
2)放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。
在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测od值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对od值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测od值就可以了。
7、同时设置调零孔（培养基、mtt、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜）。
六、mtt结果分析
关于如何计算ic50
改良寇式法:lgic50=xm-i(p-(3-pm-pn)/4)
xm:lgzui大剂量
i:lg(zui大剂量/相临剂量)
p:阳性反应率之和
pm:zui大阳性反应率
pn:zui小阳性反应率