实时荧光定量pcr，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常见的荧光定量pcr检测方法有sybr green i荧光嵌合法和荧光探针法。
sybr green i荧光嵌合法：
sybr green i 是一种能与双链 dna 结合发光的荧光染料。其与双链 dna 结合后， 荧光大大增强。因此， sybr green i 的荧光信号强度与双链 dna 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 pcr 体系存在的双链 dna 数量。sybr green i 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。pcr 扩增程序一般为 94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。sybr green i 的缺点：由于 sybr green i 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对 pcr 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
sybr green i 的优点：sybr green i 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链dna相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。
荧光探针法：
探针法通常是使用5’端带有荧光物质（如：fam等），3’端带有淬灭物质（如：tamra、eclipse、bhq等）的探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。探针的报告基团的发射波长要在淬灭基团的吸收波长范围内。
能用于实时荧光 pcr 定量的方法很多，各有优缺点，必须根据具体的实验用途进行选择。如果用于区别同源性高的序列以及进行snp分型解析等多重pcr检测，推荐用荧光探针法，而进行除此之外的real time pcr实验，我们推荐使用简单易行、成本低的sybr green i荧光嵌合法。