*法 dna探针杂交法
供试品中的外源性dna经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链dna复性而重新结合成为双链dna，称为杂交。将特异性单链dna探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链dna杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性dna对照比对后，可测定供试品中外源性dna的含量。
试剂（1）dna标记和检测试剂盒 （2）dna杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。
（3）2%蛋白酶k溶液 称取蛋白酶k 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。
（4）3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。 （5）1mol/l三羟甲基氨基甲烷（tris）溶液（ph8.0） 用盐酸调ph值至8.0。 （6）5.0mol/l氯化钠溶液
（7）0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液（ph8.0） 用10mol/l 氢氧化钠溶液调节ph至8.0。
（8）20%十二烷基硫酸钠(sds)溶液 用盐酸调ph至7.2。
（9）蛋白酶缓冲液（ph8.0） 量取1mol/l tris溶液1.0ml（ph8.0），5mol/l 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液(ph8.0）2.0ml，20%sds溶液 2.5 ml， 加灭菌水至10ml。
（10）te缓冲液（ph8.0） 量取1mol/l tris溶液（ph8.0）10ml，0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液（ph8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。
（11）1%鱼精dna溶液 精密称取鱼精dna 0.10g，置10ml量瓶中，用te缓冲液溶解并稀释至刻度， 摇匀，用7号针头反复抽打以剪切dna成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。
（12）dna稀释液 取1%鱼精dna溶液50μl，加te缓冲液至10ml。
用于探针标记和阳性对照的dna制备 用于探针标记和阳性对照的dna，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述*方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］f.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。
将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml含108个细胞细菌。取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400μl混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μl，剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450μl重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯jia烷450μl，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入ph 5.2的3mol/l醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量-20℃70％乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌te缓冲液溶解，rnase酶切，酚/三氯jia烷抽提，分子筛纯化dna，即得。
用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的dna纯度：应无rna和寡核苷酸存在；a260/a280比值应在1.8～2.0之间（测定时将供试品稀释至a260为0.2～1.0）。
用于阳性对照和标记探针的dna在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于dna杂交和探针标记。
阳性对照品的dna浓度根据下式计算
dna浓度（ng/μl）= 50×a260
阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20℃以下保存，*使用。 探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。
测定法 （1）蛋白酶 k预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应*。
注意事项：供试品的稀释
根据成品zui大使用剂量，用dna稀释液将供试品（原液）稀释至每100μl 含1人份剂量；如成品zui大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用dna稀释液将供试品稀释至每100μl 含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份剂量。
d1、d2、d3为稀释的阳性dna对照。用dna稀释液稀释至每1ml中含dna 1000ng。然后依次10倍稀释成10ng/100μl (d1)、1ng/100μl (d2)、100pg/100μl (d3)三个稀释度；如成品使用剂量较大，而且dna*（100pg/剂量）较严格时，则需要提高dna检测灵敏度，相应的阳性dna对照应稀释成100pg /100μl (d1)、10pg /100μl (d2)、1pg/100μl (d3)三个稀释度。阴性对照为dna稀释液，空白对照为未进行蛋白酶 k预处理的te缓冲液。
当供试品1/100人份剂量大于100μl时，终体积也随之增大，一般终体积为供试品体积的一倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶 k的活性。
2％蛋白酶 k溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1/20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1/10。
加入3％牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质与供试品（通常为蛋白质）的酶切条件保持一致；如供试品为其他物质，则应改用其他相应物质。
若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品dna（阳性对照、阴性对照也应再次提取dna，与供试品溶液平行）。 （2）点膜 用te缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒。用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80℃真空干烤1小时以上。
（3）杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。
结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与dna含量相对应，呈一定的颜色梯度；阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性dna对照d3，试验成立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性dna的含量。
第二法 荧光染色法（新增）
picogreen是一种高灵敏度双链dna荧光染料。该染料与双链dna特异结合形成复合物，在波长480 nm激发下产生*荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520 nm处进行检测，在一定的dna浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与dna浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的dna残留量。
试剂 （1）20×te缓冲液（200 mm tris-hcl，20 mm edta，ph7.5） 加灭菌水配置成1×te。
（2） picogreen染料 用1×te缓冲液将picogreen染料稀释200倍，应现用现配，并注意避光。
（3） dna标准品 取dna标准品适量溶于te中，制成100 μg/ml dna标准品，于-20℃条件下保存。
标准品溶液的制备 用1×te缓冲液将dna标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80 ng/ml的标准品溶液。
测定法 精密量取标准品溶液和供试品溶液各400错误！未找到引用源。l于1.5ml 离心管中，分别加入稀释后的picogreen染料400 错误！未找到引用源。l，混匀后，避光室温放置5 分钟。取250错误！未找到引用源。l上述反应液于96孔板黑色酶标板中，并做3个复孔。用荧光酶标仪于激发波长480nm、发射波长520nm处测定荧光强度。以1×te缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。 用标准品溶液的浓度（ng/ml）对其相应的荧光强度作直线回归（相关系数应不低于？），将供试品溶液的荧光强度代入回归方程，求出供试品的残余dna含量（ng/ml）。
注意事项 （1）该法dna检出限为0.3 ng/ml。dna含量在1.25-80 ng/ml范围线性较好，因此供试品dna含量在该范围内可定量测定；当dna含量低于1.25 ng/ml时应为*，表示为小于1.25 ng/ml。
（2）若供试品对回收率和精密度无干扰，则可直接测定。
（3）若精密度好，但供试品轻微干扰回收率时，无需对供试品dna做进一步纯化，可直接测定，但每次测定均应增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正。
（4）若供试品严重干扰回收率和精密度时，应采用适宜方法（参见本项目*法）纯化dna以排除干扰，直至精密度和回收率试验均符合要求。需要纯化dna后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正。