1. 引言
动态光散射 (dls) 是检测蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。accusizer® 单粒子光学传感技术 (spos) 系统可用于检测聚集蛋白粒径和浓度，可测量150nm以上的聚集蛋白浓度。图 1 显示了单抗产品热应激前后的 nicomp® dls 结果。
加热后的结果（蓝色）显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm开始的较大的聚集峰。accusizer 无法检测到 10 nm 的颗粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量数据。在这项研究中，accusizer fx nano 用于研究各种配方稳定化学物质如何影响nist标准蛋白质的最终聚集状态。accusizer fx nano也可用于 usp <787> 亚可见颗粒物测试1。
2. 材料
使用的蛋白质是 nist 标准物质 8671，批号 14hb-d002，nist mab，人源 igg1k 单抗2。在nicomp动态光散射(dls)系统上，使用35mw激光二极管源，apd检测器测量蛋白质的初次粒径。在配备两个传感器的accusizer fx nano sis系统上测量蛋白质聚集体:le-400; 0.5 – 400 μm 和 fx nano; 0.15 – 10 μm.sis进样器提供精确的样品体积，最小进样量低至100 μl且可回收。
iformulate3（图 2）板预装了配方，由 doe 设计用于合理的配方开发，用于测试配方的聚集水平。评估了蛋白配方的四个主要影响因素；ph、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度。
使用的 iformulate 板测试了以下影响因素：
• ph：5 – 7.6
• 离子强度：0 – 200 mm nacl
• 海藻糖稳定剂：0 – 10 %
• 缓冲液浓度：10 – 50 mm
3. 方法
将 nist mab 解冻并稀释至 1 mg/ml，将 160 μl 过滤的去离子水添加到 iformulate 板的每个孔中。每孔加入40 μl nist mab。将培养皿置于60°c(刚好低于蛋白质熔点)的烤箱中24小时。使用 accusizer 颗粒计数器分析每个孔。将>0.15 μm(总)和>0.53 μm的颗粒计数数据提交给iformula，由iformula进行数据分析和稳定性建模。
4. 结果
数据使用帕累托分析方法处理，帕累托分析方法在多影响因素下十分有效。帕累托分析给出了影响因素排名和影响因素之间的相互作用。图 3 和图 4 分别显示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。颜色表示配方变量对增加的颗粒计数的相对重要性，蓝色 = 重要，灰色 = 临界，红色 = 不太重要。
下面的结果显示了不同条件下聚集效应的 3d 响应曲面图。这种设计空间提供了通过检测在两个粒径范围内颗粒浓度的方法，以此来确定可最大限度减少聚集配方。图 5 和图 6 显示了在保持缓冲液和 nacl 浓度不变的情况下，改变 ph 值和稳定剂（海藻糖）的结果。
图5 ph值和稳定剂的影响>0.15μm
图6 ph值和稳定剂的影响>0.53μm
图 7 和图 8 显示了不同 nacl 和稳定剂（海藻糖）浓度的结果，同时保持缓冲液浓度稳定且 ph 值从 5.91 略微变化到 6.3。
图7 nacl和稳定剂的作用>0.15μm
图8 nacl和稳定剂的作用>0.53μm
然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行整理，图9和图10显示了最小粒子数优化图。
图9 颗粒最小化图>0.15μm
图10 颗粒最小化图>0.53μm
5. 结论
此处显示的结果表明，可减少颗粒计数并因此减少蛋白质聚集的最佳化学制剂为：
ph = 6.1 – 6.3
nacl = 40 – 70 mm
海藻糖 = 7 – 8%
缓冲液 = 50 mm
accusizer也可用于在≥10和25μm的条件下进行usp＜787＞测试，并可使用a2000 usp微孔板分析仪实现自动化。
参考资料
[1] usp <787>, subvisible particulate matter in therapeutic protein injuctions, see usp.org
[2] nist reference material 8671, lot 14hb-d-002, nist mab
[3] iformulate
[4] accusizer a2000mpa