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PCR技术三个基本反应步骤

标准的pcr过程分为三步:
第一步,dna变性(90℃-96℃)
双链dna在高温作用下,氢键断裂,形成单链dna。
第二步,退火(60℃-65℃)
温度降低,引物与dna模板结合,形成局部双链。
第三步,延伸(70℃-75℃)
在taq酶的作用下,以dntp为原料,从引物的3′端开始以从5′到3′端的方向延伸,合成与模板互补的dna链。
每一循环经过变性、退火和延伸,dna含量即增加一倍。
pcr由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板dna的变性模板dna经加 热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板dna与引 物的退火(复性)模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;引物的延伸dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。pcr的反应动力学 pcr的三个反应步骤反复进行,使dna扩增量呈指数上升。反应最终的dna 扩增量可用y=(1+x)n计算。y代表dna 段扩增后的拷贝数,x表示平(y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%, 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列dna 段的增加呈指数形式,随着pcr产物的逐渐积累,被扩增的dna 段不再呈指数增加,而进 入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、pcr扩增效率及dna聚合酶pcr的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
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