在病变的晚期会大面积感染肺组织，可能会对肺功能造成严重的损害。在过去三年中，人类干细胞衍生的类器官已经成为了新冠研究的有利工具。
人肺类器官(human lung organoid, hlos)拥有类似支气管和肺泡的结构，与人肺部组织结构功能相似，培养过程复杂。研究人员利用小分子化合物和细胞因子诱导干细胞生成了内胚层，再让内胚层形成三维组织，得到了类似胚胎中早期肺的组织，进一步使其发育成为肺部组织。
人肺类器官培养方案有很多种，接下来，我们根据han和alyssa j miller等文章总结了人类多能干细胞(hpsc)形成人肺类器官和芽尖祖细胞类器官的大致过程[1][2]。
图1 alyssa j miller等的hpsc形成人肺类器官和芽尖祖细胞类器官的过程[2]
培养方案
01
hpsc定向分化为内胚层
hpscs用accutase(40506es)处理并接种到低吸附的6孔板上，重悬于含有10 μmy-27632(53006es)、0.5 ng/mlhuman bmp4(92053es)、2.5 ng/mlhuman bfgf(91330es)、100 ng/mlhuman activin a(91702es)的无血清分化培养基中培养3-4天。
02
诱导形成前肠球体
为诱导前肠球体，更换培养基为前肠分化培养基：dmem/f12培养基中添加1×n-2(60706es)、1×b27(60704es)、10 mmhepes(60117es)、1×l-谷氨酰胺(60314es)、10 µmsb431542(53004es)、200 ng/mlhuman noggin(92528es)、1 µmsag(53257es)、500 ng/mlhuman fgf4(91303es)和2 µmchir99021(53003es)，培养5天。
然后在不破坏单层细胞的情况下收集漂浮的球体，离心后转移至新的离心管中，接种至含有matrigel胶的平板中，37°c静置。
图2前肠球体的明场图片[2]
03
诱导人肺类器官和芽尖祖类细胞器官
3.1 诱导人肺类器官
向前肠球体中加入人肺类器官诱导培养基：dmem/f12培养基中添加1×n-2(60706es)、1×b27(60704es)、1% fbs、10 mmhepes(60117es)、1×l-谷氨酰胺(60314es)、500 ng/mlhuman fgf10(91306es)进行培养，每两周换液。
大约需要50天可以产生人肺类器官，并且具有气道样上皮细胞，周围环绕着间充质细胞和表达肺泡细胞型标记物的上皮细胞的弥散网络。
图3人肺类器官预期生长模式的明场图像[2]
3.2 诱导芽尖祖细胞类器官
向前肠球体中加入人肺类器官诱导培养基：dmem/f12培养基中添加1×n-2(60706es)、1×b27(60704es)、10 mmhepes (60117es)、1×l-谷氨酰胺(60314es)、10 ng/ml humanfgf7(91304es)、0.5%bsa(36102es)、50 µg/ml抗坏血酸(53614es)、3 µmchir99021(53003es)、50 nmatra(53001es)和0.4 µm monothio-glycerol，进行培养，每2-3天换液，会生成芽尖祖细胞类器官。
培养22天后，芽尖祖细胞类器官含有高度富集和增殖的、转录类似于人类胎儿芽尖祖细胞的sox2+- sox9+id2+nkx2.1+种群细胞。
图4芽尖祖细胞类器官生长模式的明场图像[2]
相关产品
产品名称
产品编号
规格
简介
y-27632
53006es
1mg/5 mg/10 mg
rock抑制剂
sb431542
53004es
5 mg/10mg/50mg
src家族激酶抑制剂，tgf-β信号通路抑制剂
chir99021
53003es
2mg/5 mg/10 mg
gsk-3α/β抑制剂
smoothened agonist(sag)
53257es
2mg/5 mg/10 mg
smo受体激动剂
l-ascorbic acid l-抗坏血酸
53614es
1 g/5 g
维生素c，抗氧化剂
retinoic acid（维甲酸，维a酸）
53001es
100 mg/500 mg/1 g
诱导细胞分化
accutase™ 细胞消化液
40506es
100 ml
细胞消化液
human bmp4
92053es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human bfgf
91330es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human activin a
91702es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human noggin
92528es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf4
91303es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf10
91306es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf7
91304es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
n-2 supplement,serum free,100x
60706es
5 ml
用于细胞和组织体外培养
hepes溶液(1 m)，细胞培养级
60117es
100 ml
化学缓冲剂
l-谷氨酰胺
60314es
100 g
氨基酸
bsa牛血清白蛋白,诊断级别
36102es
25 g/100 g/500 g/1 kg
用于细胞培养
50× b-27无血清添加剂，去除维生素a
60704es
10 ml
无血清添加剂
参考文献
[1]han y, et al. identification of sars-cov-2 inhibitors using lung and colonic organoids. nature. 2021 jan;589(7841):270-275.
[2]miller aj, et al. generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. nat protoc. 2019 feb;14(2):518-540.