体液基质金属蛋白酶1活性荧光定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
体液基质金属蛋白酶1（mmp2）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针mca供体和dap/dnp受体双重标记的多肽底物plglar，在特定抑制剂存在与否的情况下，受到mmp1蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等样品中基质金属蛋白酶1的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。
技术背景
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases；mmps）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的mmps至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将mmps分为4大类：（1）胶原酶：mmp1、mmp8、mmp13主要消化ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅶ、ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（ⅳ型胶原酶）：mmp2、mmp9，又称明胶酶a、b，主要消化ⅳ、ⅴ、ⅶ、ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：mmp3、mmp7、mmp16、mmp11、mmp12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅶ、ⅸ胶原及mmp1、mmp8、mmp9；（4）膜型金属蛋白酶：mt1-mmp、mt2-mmp、mt3-mmp，主要作用于明胶、ⅳ型胶原、mmp2。体内绝大多数细胞并不储备mmps，当需要mmps的信号传递到细胞后才临时合成，合成的mmps以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的mmps可激活另一种mmps，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶a（gelatinase-a）或iv型胶原酶（type iv collagenase），其前体分子量为72kda，激活后分子量为62和56 kda。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5（laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-tnf-α）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。基质金属蛋白酶-1，又称间隙性胶原酶（interstitial collagenase）或成纤维细胞胶原酶（fibroblast collagenase），其前体分子量为52（未糖基化）和57（糖基化）kda，激活后分子量为42和47 kda。它的作用目标是纤维胶原蛋白（fibrillar collagens）。基质金属蛋白酶-1与风湿性关节炎（结缔组织降解）、牙周病（periodontaldiseases）和肿瘤发展转移有关；基质金属蛋白酶-1缺失将导致肌肉骨骼综合种（musculoskeletal syndrome）。基质金属蛋白酶1的活性检测通过荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer；fret），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench）。基于多肽底物plglar两端标记的供体荧光探针7-甲氧基（7-methoxycourmarin）受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[n-3-（2,4-dinitrophenyl）-l-α-β-diaminopropionyl；dap]的抑制而荧光淬灭（quench）。在特异性抑制剂gm1489（n-[(2r)-2-(carboxymethyl)- 4-methylpentanoyl]-l-tryptophan-(s)-methylbenzylamide）存在与否的条件下，一旦多肽的gly-leu键受到mmp1水解，释放出具有强烈荧光的7-甲氧基多肽片段，据此根据其荧光强度（激发波长330nm，散发波长400nm）的变化，来定量测定基质金属蛋白酶1的特异活性。其反应系统为：
产品内容
缓冲液（reagent a） 毫升
底物液（reagent b） 微升
标准液（reagent c） 微升
专性液（reagent d） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里；底物液（reagent b）和标准液（reagent c）避免光照，有效保证3月
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
选择一：血浆样品
1．准备好肝素或acd抗凝管（注意：避免使用edta抗凝管）
2．抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000rpm，例如eppendorf 5415）
4．小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
5．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
6．即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
选择二：血清样品
1． 准备好不含抗凝剂的储存管
2．抽取1毫升血液，置于储存管里
3．室温下，静置30分钟，直至血液凝结
4．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000rpm，例如eppendorf 5415）
5．小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
6．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
7．即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品
1．准备好1.5毫升离心管
2．移取1毫升液体到离心管
3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000rpm，例如eppendorf 5415）
4．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
5．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
6．即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
关键词：台式离心机 培养箱 荧光酶标仪 离心机