mrna疫苗体外合成完整解决方案
随着生命科学的不断进步，mrna作为药物被应用到疾病治疗、疫苗等领域。从1990年体外合成的mrna第一次在细胞内表达，到2020年的mrna疫苗在对抗疫苗发挥重要作用。以mrna为基础的治疗方式已经在医药领域引起了一场革命。mrna（messenger rna、信使rna）是将dna中的基因信息传递到蛋白的中间信使。mrna疫苗治疗（见下图）是指在体外合成mrna，将其导入体内，mrna进入细胞后翻译表达出抗原蛋白，抗原刺激体内免疫系统，激活体液免疫和细胞免疫，当机体再次接触同种抗原（细胞/病毒）mrna疫苗体外合成完整解决方案，可产生快速免疫应答反应，自我保护。mrna疫苗具有研发速度快、灵活、生产工艺简单、平台化、容易扩充产能，可以用于精准化和个性化治疗，一次可呈递多种抗原等优点。mrna疫苗属于第三代疫苗技术（见下图），相比于传统疫苗需要通过将病原微生物及其代谢产物通过人工灭毒﹑减活﹑基因工程的方法制成的繁杂工序，第三代疫苗特异性更强，有效性更高，并且研发周期较快。它的结构简单、可人工批量合成，并且可以在研发阶段进行高通量筛选，大大节省研发时间。而且相较于dna疫苗，mrna疫苗没有导入外源基因的遗传风险，起效更快，效果更强。mrna疫苗相对于其他疫苗的优势图片引用于网络mrna疫苗具有工艺通用性好，研发速度快，能够活化细胞免疫，刺激效果好，递送效果好等特性。高的mrna产量需要高效的mrna体外合成方法，大规模生产选择t7 rna聚合酶体外转录。增强mrna的稳定性，降低免疫原性并提升翻译效率，*的解决方案是：使用加帽酶对mrna进行加帽，使其在细胞内外稳定，降低免疫原性，并且使mrna可以被核糖体识别，启动翻译程序。提供一系列mrna体外合成酶及试剂，解决mrna疫苗的关键痛点。所有产品均采用药用规格原辅料生产，严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留及常见病原体污染，符合gmp规范的产品生产与质量管理规程，保障生产过程及所有原辅料可追溯。产品特点：gmp级mrna体外合成及修饰原料，animal-free，ampicillin-free产品生产、质量控制及配套文件体系，符合mrna疫苗及药物研发生产需求经过临床使用验证，单批次产能千万人份，年产能50亿人份 mrna疫苗体外合成关键步骤及相关产品：1、生成模板-质粒线性化 相关产品：bsa i，gmp grade（货号：gmp-re026） 此步将构建好的质粒酶切，处理成线性化双链dna模板，用于下一步mrna合成。 限制性内切酶bsa i 特异性识别双链dna中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，作为mrna体外合成模板； 酶切位点：产品特点： 强特异性 受cpg、dcm甲基化影响，剪切阻断 受ecobi甲基化影响，剪切可能受影响 不受dam甲基化影响2、mrna体外合成 相关产品：t7 rna polymerase, gmp grade (货号：gmp-e121)此步以dna为模板，在体外由rna聚合酶催化合成mrna。t7 rna polymerase（t7 rna聚合酶）是高度特异识别t7启动子序列的5'→3' rna聚合酶，以含有t7启动子序列的单链或双链dna为模板，以ntp为底物，合成与启动子下游的单链dna互补的rna。t7 rna聚合酶是体外转录mrna的关键酶。产品特点：高度特异识别t7启动子20ul反应体系，产量可达150ug可对低至1ng模板进行有效转录合成长度可达15k体外转录产生的mrna，qsep1结果显示，纯度高，均一性好。3、mrna转录后修饰：加帽加尾 此步对mrna进行修饰，合成功能完整的mrna。完整mrna结构3.1、mrna加帽(cap0) 相关产品：vaccinia capping enzyme, gmp grade (货号：gmp-m062) 此步与3.2同时进行，在mrna的5'端加上cap0帽结构。在真核生物中，转录后的mrna必需经过一系列修饰才能形成完整的结构，即在5'端形成一个帽子结构（cap1），3’端形成polya尾结构。这些结构与mrna的稳定、转运和翻译密切相关。vaccinia capping enzyme（牛痘病毒加帽酶）用于给体外转录合成的mrna催化加上帽子结构（cap0），显著改善mrna的稳定性和翻译能力，使mrna可在细胞内表达蛋白，避免核酸外切酶等的降解破坏。mrna的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mrna 链的5′核苷上组成。cap-0结构由相邻的rna链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2-o甲基转移酶（cat. no: gmp-m072, novoprotein）参与，该修饰可以降低rna在体内引起的细胞先天免疫反应。产品特点：高效完成mrna加帽cap0 提高mrna的稳定性，防止被rna酶降解 提高mrna的翻译效率，提高蛋白产量3.2、mrna加帽(cap1) 相关产品：mrna 2’-o-methyltransferase, gmp grad e (货号：gmp-m072)此步与3.1同时进行，在mrna的5'端加上cap0帽结构的基础上，再将cap0转化为cap1结构。真核生物中，mrna的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成polya尾结构。这些结构与mrna的稳定、转运和翻译密切相关。已知cap1结构存在于所有真核生物mrna，在稳定mrna结构和提高翻译效率方面起重要作用。研究表明，体外转录修饰得到的cap1结构mrna更不容易被免疫系统的rna感受器（rig-i）识别，因此免疫刺激更低。mrna cap 2´-o-methyltransferas （2´-o-甲基转移酶）可利用 s-腺苷甲（sam）作为甲基供体， 在 rna 5´末端紧邻帽结构（cap 0）的第一个核苷酸的 2´-o 上添加甲基基团，形成带有 cap 1 结构的 mrna。cap1 结构能增强 mrna 的翻译效率，从而可提高转染后 mrna 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构（m7gpppn）的 rna 为底物，不会作用于 5´末端为pn、ppn、 pppn 或 gpppn 的 rna。带 7-甲基鸟苷帽结构（m7gpppn）的 rna 可通过 vaccinia capping system（cat. no: gmp-m062, novoprotein）来制备。产品特点：使mrna的cap 0帽子甲基化为 cap 1帽子提高 rna 的翻译效率，提高蛋白产量进一步降低免疫原性完整mrna在细胞内表达gfp蛋白，加帽酶与帽类似物对比3.3、mrna加尾(polya) 相关产品：e. coli poly(a) polymerase, gmp grade (货号：gmp-m012)此步在mrna的3'端加上polya尾。真核生物中，mrna的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成polya尾结构。这些结构与mrna的稳定、转运和翻译密切相关。poly a与成熟mrna的稳定性、翻译起始以及出核运输有关，体内转录后修饰中，polya聚合酶在rna 3’-oh上逐一引入100-200个a碱基。体外转录rna过程中，e. coli poly (a) polymerase（加尾酶） 不依赖模板的存在，可以催化 atp 以 amp 的形式依次掺入到 rna 的 3´末端，即在 rna 的 3´末端加多聚 a 尾。poly (a) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 rna 的 3´末端加入 20~200 个 a 碱基。zui大程度还原体内加尾过程。产品特点：稳定mrna的存在形式引导转录终止提高rna在真核细胞中的翻译效率4、其他相关产品4.1、防止mrna降解 相关产品：rnase inhibitor, gmp grade (货号：gmp-e125)在流程2-3 mrna合成与修饰中加入rnase inhibitor，防止rna降解。rnase inhibitor可与rnase a形成1：1复合体，对rnase 有极qiang非竞争性抑制，保护mrna转录后不被降解产品特点：强抑制rnase活性稳定性强4.2、降解模板dna 相关产品：dnase i, gmp grade (货号：gmp-e127) 在流程2 rna合成结束后，去除模板dna。dnase i将单链或双链dna随机分解。dnase i 去除rna样本种的dna残留4.3、增加mrna产量 相关产品：pyrophosphatase, inorganic (yeast), gmp grade (货号：gmp-m036) 在流程2 rna合成过程中加入无机焦磷酸酶，增加rna产量。 无机焦磷酸酶ppase（pyrophosphatase, inorganic）可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐（p2o7-4+h2o+ppase→2hpo4-2），一方面可去除无机焦磷酸盐对反应体系的抑制，另一方面为反应提供热力学动力，促进产物的生成。常用于rna、dna、蛋白质的生物合成中，是一种良好的辅剂，在mrna疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。无机焦磷酸酶去除mrna合成过程中产生的焦磷酸，提高mrna产量