动静脉畸形 （avms） 是由供血动脉和引流静脉之间的直接连接引起的局部血管异常，没有中间毛细血管网络。脑部动静脉畸形可导致广泛的器官损伤，继发于癫痫和自发性颅内出血。然而，由于脑avms（cavms）病灶的复杂血管特性，该疾病的分子发病机制尚未确定。
最近的研究发现，内皮到间充质转化（endmt）可导致avm病灶的形成。endmt过程与内皮细胞对间充质标志物的表达有关，表现为ec的增殖和侵袭、ec连接紊乱和形成梭形状。然而，endmt的潜在机制和触发因素是模糊的。notch信号通路是一种重要的生物学通路，它将血流动力学机械信号与生化信号级联联系起来，并决定细胞命运。值得注意的是，增强和减弱的notch信号通路都与动静脉分流的发展有关。由于直接动静脉分流和病灶形成，avms的血流动力学发生高度改变。血流紊乱已被证明对血管内皮层有深远影响。鉴定响应扰动流而触发 endmt 的调节分子可能为治疗 cavm 的药理学方法提供新的见解。
在印度拉吉夫甘地生物技术中心、sree chitra tirunal医学科学和技术研究所等研究团队的一项最新研究中，观察到人类cavm病灶中存在活化的notch受体和endmt标志物，还发现avm病灶样品中细胞粘附分子的失调。使用体外流体模型，该研究为内皮细胞中剪切应力-notch3-endmt轴的改变提供了证据。notch信号在感知剪切应力波动和将细胞编程成间充质特征方面起着关键的中介作用，他们发现剪切应力诱导的细胞侵袭性改变需要活跃的notch信号。此外，还探讨了γ-分泌酶抑制剂（gsi）、dapt和ro4929097在剪切应力改变的情况下预防notch诱导的endmt和细胞侵袭的效用。
cavm病灶中endmt和细胞粘附标志物的失调
早期研究表明，cavm病灶的主要血管具有动脉、静脉、毛细血管以及内皮标志物。经历间充质转化的内皮细胞表现出改变的形态特征，随后间充质蛋白如转凝蛋白（sm22-α）、钙调蛋白等增加。实验观察到，在mrna转录本水平上，snai1、slug（snai2）、转凝蛋白（tagln）和钙调蛋白1（cnn1）在cavm样本中高表达。与对照相比，snai2在cavm中的表达比snai1更突出（图1 a）。
在endmt过程中，内皮细胞和基底膜的细胞-细胞和细胞-ecm粘附将被破坏。这些分子变化促进了内皮细胞的侵袭性。因此，研究了cavm病灶中钙粘蛋白和整合素等粘附因子的表达。ve-钙粘蛋白（cdh5）在患者样本中下调，而cavms中的n-钙粘蛋白（cdh2）mrna上调。整合素α9亚基（itga9）mrna在cavms中过表达，但整合素β1（itgb1）mrna降低。
此外，在avm和对照组织中进行了基于免疫组织化学染色的endmt蛋白表达和定位分析。实验观察到在avm大血管的内膜区域存在snai1/2的过表达（图1 b）。 snai1/2在对照脑血管系统中不表达。与对照组相比，nidal样本中的snai1/2增加了约4倍（图1 c）。钙调蛋白1和转凝蛋白在 cavm 血管巢的内膜和中膜中均强烈表达。转凝蛋白表达存在于对照组的小血管中，但钙调蛋白1在对照血管系统中不表达。
n-钙粘蛋白定位于病灶组织的新生内膜区域，在对照标本中未观察到。也没有在任何患者样本的内层中观察到n-钙粘蛋白。与对照血管系统相比，发现整合素的活化形式α9/β1在cavm病灶中下调。
图1 脑动静脉畸形中 endmt 和主要细胞粘附标志物的失调。
脑动静脉畸形表达更高水平的nicd3和nicd4
实验最初研究了cavm病灶中所有四个notch受体基因notch 1-4的表达，发现notch3和notch4 mrna在病灶标本中显著过表达。然后专门研究了激活的notch受体的表达，即cavm组织切片和对照脑样本中的notch细胞内结构域（nicd）。nicd3被发现高度表达并定位于血管巢的内膜和中膜，表明endmt。cavm中的nicd4受体水平较低，并且呈弥散模式，更靠近内膜，较少在中膜分布。蛋白质印迹分析进一步证实了avm病灶中nicd3的表达升高。
振荡流促进 γ-分泌酶依赖性 notch 受体的激活
为了确定内皮细胞中是否发生振荡剪切应力依赖性notch受体活化，实验使用流动室在暴露于规定流动条件下的hcmecs中进行基于qrt-pcr的mrna分析和蛋白质免疫荧光测定，分析了暴露于平行剪切应力（15 dyn/cm2）24 h的hcmecs中的基因表达谱。结果发现，notch1-4在平行单向流动条件下的mrna表达与静态流动条件下的表达没有显著差异（图2 a）。与静态相比，振荡流（15 dyn/cm2）诱导内皮细胞中notch3（4.11倍）和notch4（2.06倍）mrna的过表达。与暴露于平行流的细胞相比，振荡流分别导致notch3和notch4增加了3.2倍和1.96倍。与静态条件相比，平行流和振荡流均未在hcmecs中诱导显著的notch1和notch2表达（图2 a）。
接下来，研究了暴露于各种流动条件的 hcmecs 中的 nicd 1、3 和 4 蛋白水平表达及其细胞定位。与平行流和静态条件相比，暴露于振荡剪切应力的内皮细胞中存在nicd3的过表达。振荡剪切应力通过促进nicd3的核定位改变了notch3受体的亚细胞定位。还发现细胞在24小时后以纺锤状形态拉长。nicd4表达略有升高，但定位主要是细胞质。nicd1在三种流动条件下的细胞中均未显著表达，但mfi分析表明暴露于振荡流的细胞中略有过表达（图2 b、c）。
此外，还研究了振荡剪切应力是否通过诱导γ分泌酶活性直接诱导notch受体激活，用0.5µm dapt和250 nm ro4929097对暴露于振荡流24 h 的hcmecs进行处理。两种抑制剂都对hcmecs中γ-分泌酶诱导的notch3受体的剪切应力反应产生了负面影响（图2 d）。然而，ro4929097更具有统计学意义（图2 e）。蛋白质印迹分析进一步证实了暴露于振荡流的细胞中nicd3蛋白水平表达升高（图2 f）。
图2 通过人脑微血管内皮细胞（hcmec/d3）中的振荡液流激活notch受体。
振荡流诱导的 endmt 需要 notch 受体激活
hcmecs被用来研究振荡剪切应力下内皮标志物的丧失和间充质特征的增强。mrna表达分析显示，与静态相比，暴露于振荡剪切应力的细胞中间充质cnn1和tagln上调。关键的endmt标记物snai1和snai2的mrna在振荡流暴露细胞中也分别过表达3.59倍和3.83倍（图3 a）。在暴露于振荡流的细胞中，与snai1相比，slug表达略高，证实了cavm中的发现。
对暴露于静态、平行和振荡剪切应力的hcmecs中的snai1/2进行免疫荧光分析。与其他流动状态相比，snai1/2 在振荡流的细胞中过表达并定位于细胞核（图3 b）。mfi分析表明，与静态流和平行流相比，snai1/2表达分别增加了3.8倍和3.1倍（图3 c）。
为了评估hcmecs中notch通路在剪切应力诱导的endmt中的参与，在振荡流过程中使用了gsi dapt（0.5μm）和ro4929097（250 nm），并监测endmt因子的表达。在振荡应力期间snai1/2在dapt和ro4929097 下分别降低了约60%和80%，而抑制notch受体切割消除了此影响（图4 a、b）。这些数据表明，振荡剪切应力诱导的endmt需要notch 信号。γ-分泌酶抑制剂ro4929097在改变流动条件下减少内皮细胞的间充质表型非常有效。
图3 微血管内皮细胞中的振荡流对 endmt 和细胞粘附标志物的差异表达。
图4 γ-分泌酶抑制剂（gsi）调节振荡剪切诱导的endmt和细胞侵袭性。
ro4929097促进细胞粘附并减少暴露于振荡流细胞的侵袭性
为了证实cavm组织中细胞粘附因子失调的发现，通过qrt-pcr研究了暴露于各种流动条件的内皮细胞中内皮ve-钙粘蛋白，间充质n-钙粘蛋白和整合素亚基α9和β1的基因的mrna表达。在暴露于振荡剪切应力的细胞中n-钙粘蛋白和整合素α9上调，而ve-钙粘蛋白和整合素β1下调（图3 a）。
暴露于剪切应力条件的细胞中这些粘附因子的免疫荧光测定表明，与暴露于静态和平行剪切应力的细胞相比，振荡剪切应力下的细胞中n-钙粘蛋白上调。在暴露于振荡流24 h 的细胞中发现激活的整合素α9/ β1显著降低（图3 b、c）。
dapt和ro4929097显著降低了暴露于持续振荡流的细胞中的n-钙粘蛋白。有趣的是，在dapt和ro4929097 存在下，整合素α9/ β1表达分别增加了45.5%和56.7%（图4 a、b）。
细胞侵袭性增加是endmt的一个重要结果。为了研究hcmecs在流动状态下的侵袭特性，使用matrigel跨膜侵袭测定。先前将细胞暴露于振荡剪切应力24小时诱导内皮侵袭性增加，dapt和ro4929097均基本阻断了内皮细胞的侵袭性（图4 c）。与dapt相比，ro4929097有效防止细胞侵袭（图4 d）。这一发现表明，靶向notch信号通路的药物干预可以有效降低血流诱导的血管内皮细胞侵袭能力和endmt。
图5 图形概要
总之，该研究表明，在人类cavm病灶中存在notch受体和endmt标志物。这是第一份报告，表明改变的血流诱导的notch信号导致cavms中的endmt，提供了notch信号在内皮细胞暴露于干扰流中增强细胞侵袭性的直接作用的证据。
参考文献：karthika cl, venugopal v, sreelakshmi bj, krithika s, thomas jm, abraham m, kartha cc, rajavelu a, sumi s. oscillatory shear stress modulates notch-mediated endothelial mesenchymal plasticity in cerebral arteriovenous malformations. cell mol biol lett. 2023 mar 18;28(1):22. doi: 10.1186/s11658-023-00436-x. pmid: 36934253; pmcid: pmc10024393.