cellscript™的使命是提供简单安全高效的转录产品和技术,用于制造和使用rna以便进行临床研究和治疗的细胞翻译。
目前的产品包括多种体外转录试剂盒、加帽类似物或加帽酶的5' rna加帽试剂盒和3' rna多聚腺苷酸化的试剂盒,以及用于转录、加帽、poly(a)尾mrna以进行翻译的多合一试剂盒。
其中,scriptcap™ cap 1 capping system(c-sccs1710)包含scriptcap加帽酶、scriptcap 2'-o-甲基转移酶、gtp和sam等成分,对体外转录的rna进行转录后加帽修饰。cap 0或cap 1上限均可构建,效率接近100%(这不能通过共转录加帽方法来完成)。
scriptcap加帽酶在体外催化具有5‘-三磷酸基的初级rna的5’末端加成帽核苷酸。“帽核苷酸”或“帽”是一种guanine核苷,它通过5‘c连接到一个三磷酸基团,然后再连接到初级mrna转录本中最多的5’核苷酸的5‘碳上,在大多数真核生物中,帽核苷酸中guanine7位的氮是甲基化的。表示为:m7g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3')。其中m7g代表n7-甲基guanine核苷,ppp代表帽子核苷的5’碳与初级rna转录本的第一个核苷酸之间的三磷酸桥,n1(pn)x-oh(3’)代表初级rna转录本,其中n1是最多的5’核苷酸。
scriptcap加帽酶可依次催化三种不同的酶反应:
(1) rna三磷酸酶将rna的5‘三磷酸裂解成二磷酸:
pppn1(p)nx-oh(3')——ppn1(pn)x-oh(3') + pi
(2) rna鸟苷酸转移酶将gtp连接到rna最5‘核苷酸(n1)的5’二磷酸上:
ppn1(pn)x-oh(3') + gtp——g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3') + ppi
(3) guanine-7-甲基转移酶以s-腺苷methionine(sam或adomet)为辅因子,催化帽核苷酸中guanine7-氮的甲基化:
g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3') + adomet——m7g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3') + adohyc
这一过程被称为“盖帽”,与未盖帽的rna相比,它提高了rna的稳定性和翻译效率。scriptcap盖帽酶构建的封端rna产物具有“0”帽结构。在体外,通过同时使用scriptcap 2‘-o-甲基转移酶和scriptcap盖帽酶,可以将cap0 rna转化为“cap1”结构。
scriptcap 2‘-o-甲基转移酶通过将供体分子sam上的甲基转移到cap 0 rna倒数第二个核苷酸的2’-o位,从cap 0-rna制备cap1-rna,合成具有cap 1结构的rna。
cap1 rna可以进一步提高mrna的体内翻译效率,并有助于将mrna标记为相对于细胞内免疫监视机制的“自身rna”。
scriptcap1盖帽系统提供了一种在ivt反应中通过共转录盖帽来制造盖帽rna的替代方案,在ivt反应中,用二核苷酸盖帽类似物(例如m7gpppg)代替部分gtp,如果rna的5‘末端不是结构化的,使用scriptcap 1盖帽系统的盖帽效率可以接近100%。相反,由于cap类似物与gtp竞争rna聚合酶的转录启动,共转录的盖帽效率受到cap类似物的浓度及其与gtp浓度之比的限制。因此,在转录反应中使用cap类似物盖帽的rna百分比总是小于100%。在使用cap类似物的共转录盖帽反应中可以产生的cap rna的量也受到降低gtp浓度以允许cap类似物竞争转录起始的需要的限制。另一方面,如果要盖帽的rna具有高度结构的5‘末端,则与cap类似物共转录盖帽可能是有益的。
优势:灵活进行cap0和cap1的加帽;效率*,接近100%;同类产品可直接交叉使用以及价格合适。
应用:进行体外mrna的修饰,用作体外蛋白表达系统和生理试验;前体mrna的研究试验以及疫苗研究。