蛋白质含量是*质量评价的重要指标。不确定度是与测量结果相关联的参数,表征合理地赋予被测量值的分散性。本文对凯氏定氮法测定*中蛋白质含量的不确定度来源和大小进行分析和评价,并初步探讨在运用该方法的过程中应注意的问题,旨在为*以及食品（尤其是乳制品）中的蛋白质含量测定提供一定参考。推荐使用仪器：，（）。
　实验材料及条件
1.1　仪器及试药
仪器:自动定氮仪（ gerhardt vapodest 30 digestsystem） ;玻璃仪器（ 1、2、10 ml 移液管; 20、100 ml容量瓶; 25 ml酸式滴定管） , 20 ℃下校准。试药:*（贵阳黔峰生物制品有限公司生产, 批号为20070830, 规格为20% , 10 g） ;01005 mol·l - 1硫酸滴定液（本所化学室标定） ;10%钨酸钠溶液; 0133 mol·l - 1硫酸溶液; 2%硼酸溶液; 40%氢氧化钠溶液;甲基红-溴甲酚绿混合指示液; 98%硫酸;*;硫酸铜。
1.2　实验室环境
温度变化范围: （20 ±4） ℃。
　方法
2.1　试验过程
按照中国药典2005年版三部的规定,测定*中的蛋白质含量,过程见图1。
2.2　建立数学模型
*中蛋白质含量w 的计算公式为:
rep为总重复性因子。
以y表示w , xi表示第i个影响参数,得y的合成标准不确定度为:
其中ci为灵敏系数,记为偏导5y /5x; u （ y, xi ）为由xi不确定度引起的y的不确定度。
　不确定度的来源及分析
3.1　不确定度的来源
从*中蛋白质含量测定流程图来看,凯氏定氮法测定蛋白含量的不确定度主要来源于9个方面: 1）试验重复性; 2）标定硫酸滴定液浓度; 3）稀释硫酸滴定液; 4）测定总氮稀释样品; 5）滴定总氮吸取样品; 6）滴定总氮实际消耗硫酸滴定液的体积; 7）测定非蛋白氮稀释样品; 8）滴定非蛋白氮吸取样品; 9）滴定非蛋白氮实际消耗硫酸滴定液的体积。
3.2　不确定度u （ xi ）的量化分析
3.2.1　由试验重复性引入的标准不确定度u （ rep）按药典标准对*样品平行测定6次,结果见表1。
测量的标准不确定度: u （ rep） = s /6015 = 01002 4
3.2.2　标定硫酸滴定液浓度引入的不确定度u （cd ）由标定01005 mol·l - 1硫酸滴定液所引入的不确定度u （cd ） = 111 ×10- 4 mol·l - 1。
3.2.3　稀释硫酸滴定液引入的不确定度u （vd1 / vd2 ）
试验中需将01052 32 mol·l - 1硫酸滴定液定量稀释成01005 232 mol·l - 1 ,根据《常用玻璃量器检定规程》查得,*1010 ml移液管和*100 ml容量瓶的允许偏差分别为±0102和±0110 ml ,近似于三角形分布,换算成校准不确定度分别为: 0102 /6015 = 01008 2 ml, 0110 /6015 = 01041 ml。该容量瓶和移液管均在20 ℃校准。本实验室温度变化范围为（20 ±4） ℃,近似于矩形分布。水的膨胀系数为211 ×10- 4。换算成温度不确定度分别为:
3.2.4　测定总氮稀释样品（vt1 / vt2 ）引入的不确定度u （vt1 / vt2 ）
由《常用玻璃量器检定规程》可知,*110 ml移液管和a 级20 ml 容量瓶的允许偏差分别为±0.007和±0.02 ml,近似于三角形分布,换算成校准不确定度分别为:
3.2.5　滴定总氮吸取样品（vt3 ）引入的不确定度u （vt3 ）与“31214”项相同,*110 ml移液管的的校准不确定度为01002 9 ml,温度不确定度为01000 48 ml。
由上述不确定度分量合成得:
u （vt3 ） = （01002 92 + 01000 482 ） 015 = 01002 9 ml
3.2.6 　滴定总氮实际消耗硫酸滴定液的体积（vt4 - v0 ）引入的不确定度u （vt4 - v0 ）1）肉眼判断终点所引入的不确定度已包含在测量重复性引入的标准不确定度u （ rep ）中,此处不再考虑; 2）滴定管引入的标准不确定度:由《常用玻璃量器检定规程》可知, 2510 ml的*滴定管其zui大容量的允许偏差为±0104 ml ,近似于三角形分布,换算成校准不确度为:
3.2.7　测定非蛋白氮稀释样品（vn1 / vn2 ）引入的不确定度u （vn1 / vn2 ）由《常用玻璃量器检定规程》可知,*210 ml移液管和a 级20 ml 容量瓶的允许偏差分别为±01010和±0102 ml.,近似于三角形分布.,换算成校准不确定度分别为:
3.2.8　滴定非蛋白氮吸取样品（vn3 ）引入的不确定度u （vn3 ）
u （vn3 ）即由510 ml 移液管引入的不确定度。由《常用玻璃量器检定规程》可知, *510 ml 移液管的允许偏差为±01015 ml. ,近似于三角形分布.,换算成校准不确定度为:
01015 /6015 = 01006 2 ml
温度不确定度为:
510 ×211 ×10 - 4 ×4 /3015 = 01002 4 ml
由上述不确定度分量合成得:
u （vn3 ） = （01006 22 + 01002 42 ） 015 = 01006 6 ml
3.2.9　滴定非蛋白氮实际消耗硫酸滴定液的体积（vn4 - v0 ）引入的不确定度u （vn4 - v0 ）
1）肉眼判断终点所引入的不确定度已被包含在测量重复性引入的标准不确定度u （ rep ）中,在此处不再考虑。2）滴定管引入的标准不确定度:查标准得2510 ml的*滴定管其zui大容量的允许偏差为±0104 ml ,近似于三角形分布,换算成校准不确度为:
3.3　不确定分量及各分量分析
在不确定度表达式中,假如y （ x1 , x2 , ⋯, xi ）对xi是线性或与xi相比其u （ xi ）较小,偏导（ 5y /5x）可近似为:5y /5x≈ { y [ xi + u （ xi ） ] - y （ xi ） } /u （ xi ）将u （ xi ）计入,获得因xi不确定度引起的y的不确定度u （ y, xi ） ,即:
u （ y, xi ）≈ y{ x1 , x2 ⋯[ xi + u （xi ） ]⋯xn } - y （x1 , x2 , ⋯, xi , ⋯, xn ）
根据上式,由各不确定分量u （xi ）进行计算可得到对应的u （y, xi ） ,结果见表2。
314　合成标准不确定度及扩展不确定度的计算根据表2结果,可得合成标准不确定度（ uc ）为:
扩展不确定度（u）的计算公式为: u = k·uc置信因子（ k）取2,即置信概率为95% ,可得:
u = 0.62% ×2 = 1.2%故*中蛋白质含量w （% ）可表示为（104.7 ±1.2） %。
　讨论
根据小分量不确定度不足zui大分量不确定度的1 /3时,小分量不确定度可以忽略不计的原则,由以上的评定结果可看出,本方法测定结果的不确度主要来源于6个分量:测定总氮稀释样品的不确定度u （vt1 / vt2 ） 、滴定总氮吸取样品的不确定度u （vt3 ） 、测量重复性u （ rep ） 、标定硫酸滴定液浓度的不确定度u （cd ） 、滴定总氮实际消耗硫酸滴定液的不确定度u （vt4 - v0 ） 、稀释硫酸滴定液的不确定度u （vd1 / vd2 ） 。
在试验中使用的玻璃仪器均为*,因此不能通过提高仪器的精密度改善结果,但可采取下述2个措施降低本方法的不确定度。1）使用较大规格的移液管。u （vt1 / vt2 ） 与u （vt3 ） 较大的原因是110 ml移液管引入的不确定度明显大于较大规格的移液管。故在使用本方法测定样品时,在样品量允许的前提下,通过重新设计试验步骤,在吸取样品时选用较大规格的移液管,将能显著降低u （vt1 / vt2 ）与u （vt3 ） 。2）使用合适的自动化仪器进行样品消化及滴定,同时规范试验操作,严格控制试验条件,将能有效控制试验过程中产生的随机误差,从而降低u （ rep）。
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