本文要点：本研究合成了具有nir-ii激发和发射的肾清除金纳米簇（au ncs）。使用nir-ii光激发成像可提供深层组织穿透力、高分辨率和高信噪比。此外，开发的au ncs的量子产率高达1.4-2.0%，比以前的肾可清除nir-ii发射材料高出近10倍。这些显著的优点使au ncs能够实现高分辨率荧光成像，以及监测由肾缺血再灌注和单侧输尿管梗阻引起的肾功能障碍。本文的研究结果为nir-ii荧光成像提供了新的候选材料，并为肾脏疾病的高分辨率和精确成像提供了强大的工具。
肾功能障碍在最初阶段的症状非常隐蔽，但后期可能导致肾功能不全、肾衰竭，甚至死亡。据估计，每年有300万人患末期肾脏疾病，死亡数超过百万。因此，早期实时监测肾功能不全对开展保护性干预和预防肾脏疾病的发展具有重要价值。
通过第二近红外（nir-ii）荧光成像可以实现体内肾功能障碍的实时监测，对肾脏疾病的诊断和维护患者健康具有重要意义。然而，目前开发的肾脏可清除nir-ii荧光材料的光稳定性差、量子产率低、激发波长短（均位于nir-i区域），导致相邻生物组织中的背景信号高，肾脏成像的分辨率和信噪比低，限制了其在肾脏疾病研究中的应用。开发具有优异光物理性质的新型肾清除nir-ii发光材料十分具有挑战性，但在该领域有巨大价值。
本研究合成了具有nir-ii激发和发射双重功能的肾透明金纳米团簇（gold nanoclusters, au-ncs），具有深层组织穿透、高信号背景比和高量子产率等特点。这些优点使au-ncs能够实现高分辨率荧光成像，以及监测肾缺血再灌注（renal ischemia reperfusion, rir）和单侧输尿管梗阻（unilateral uretera obstruction, uuo）引起的肾功能障碍（方案1）。本研究为nir-ii荧光成像提供了新的候选材料，并为肾脏疾病的高分辨率和精确成像提供了有力的工具。
方案1. 双配体稳定的au ncs的示意图和nir-ii窗口中肾脏功能障碍的荧光成像监测。
在本研究中，通过两步反应在水相中合成了一系列双配体稳定的au ncs。au-配体复合物是通过将haucl4与mha和另一种配体（包括cystm、me、dtt）混合，并在碱性条件下用nabh4还原而形成的。透射电子显微镜（tem）图像显示，双配体稳定的au ncs是具有良好单分散性的超小球形颗粒（图1a-d）。双配体au ncs与单配体mha-au ncs的吸收和发射光谱存在明显差异，双配体au ncs在1000nm附近显示出明显的吸收峰（图1e）；其nir-ii发光相较于单配体mha-au ncs增强了近16倍（图1f-g）。使用nir-ii荧光染料ir-26作为参考，计算得mha/cystm-au ncs、mha/me-au ncs和mha/dtt-au ncs的qy分别为1.4%、2.0%和1.7%，明显高于先前开发的肾可清除nir-ii荧光材料的值，说明au-ncs作为肾透明荧光材料在生物成像应用中具有潜力。
图1. nir-ii荧光图像、tem图像和所制备的mha-au ncs（a）、mha/cystm-au ncs（b）、mha/me-au ncs（c）和mha/dtt-au ncs（d）的尺寸分布。（e）au ncs的紫外-可见-近红外吸收光谱。（f）au ncs的荧光发射光谱。（g）au ncs的发光强度的比较。
作者以mha/cystm-au ncs为模型，在水中使用1% intralipid模拟生物软组织进行成像，进一步评估了它们的nir-ii荧光成像的穿透深度、分辨率和sbr。发现穿透深度随着激发波长增加而增加（图2a），1064nm激发下检测到的荧光信号高于980和808 nm激发下的荧光信号，且荧光强度因材料厚度增加而降低的程度明显更小（图2b-c）。随着激光和滤光片波长的增加，sbr不断增加，毛细管半峰全宽逐渐减小（图2d，e）。这些结果表明，采用长波长激发可以提高nir-ii成像的穿透深度、分辨率和sbr，也进一步证明了双配体稳定的au ncs用于生物成像的潜力。
图2. （a）在不同激发（808、980和1064nm）下，用浸入1% intralipid中的mha/cystm-au ncs溶液填充的毛细管的荧光图像。（b）来自（a）的沿着黄色箭头的横截面荧光强度分布。（c）mha/cystm-au ncs在不同厚度（3、5和7mm）的intralipid和不同激发激光下的荧光信号强度。（d）用不同的激发激光器和过滤器（2mm 1% intralipid下）对填充有mha/cystm-au ncs溶液的毛细管进行nir-ii荧光成像。（e）截面荧光强度分布图（黑色）和沿（d）中黄线的高斯拟合线（红色）。
接着作者进行了体内荧光成像研究，通过小鼠尾静脉注射icg、mha-au ncs和双配体au ncs，在1064nm的激发下于nir-ii窗口中成像，探究所合成的au ncs在肾脏中的成像性能。如图3a所示，注射mha/cystm-au ncs后5分钟，肾脏即被清晰区分，并且没有观察到来自邻近组织的明显干扰信号。随着mha/cystm-au ncs从肾脏中清除，肾脏区域的荧光强度逐渐降低，接着au ncs通过输尿管进入膀胱，在10分钟时可观察到膀胱区域的荧光信号，并在注射后3小时达到max值。随后，au ncs随尿液排出体外。值得注意的是，mha/cystm-au ncs的肾脏成像分辨率远高于先前文献中报道的分辨率，肾脏区域的sbr高达4.53（图3b-c）。与mha/cystm au nc相比，icg和其他au ncs对肾脏的成像能力相对较弱，sbr值相对较低。这证明了mha/cystm-au ncs具有良好的肾脏成像能力。
图3.（a）静脉注射mha/cysm-au ncs后24小时内km小鼠的nir-ii荧光成像。（b）分别在静脉注射mha/cysm-au ncs、mha/me-au nc、mha/dtt-au ncs、icg和mha-au ncs后5分钟km小鼠的nir-ii荧光成像。（c）来自（b）的沿着黄线的横截面荧光强度分布（黑色）和高斯拟合线（红色）。
在上述研究的基础上，作者使用mha/cystm-au ncs分别对rir和uuo诱导的肾功能障碍进行成像，以评估其实际应用能力。
rir是肾脏疾病手术中的一种常见现象，容易导致急性肾损伤，并有发展为终末期肾脏疾病、带来高死亡率的风险。作者通过手术夹闭小鼠肾动脉和静脉建立rir小鼠模型。将两个实验组小鼠的左肾分别夹紧30和60分钟；假手术组在没有夹肾的情况下进行了相同的手术，然后在术后15分钟静脉注射mha/cystm-au ncs，在注射后的不同时间点对小鼠进行成像（图4a）。成像结果如图4b所示。在假手术组小鼠中，左肾和右肾的荧光强度相当，并具有相同的衰减趋势（图4c-d）；对于缺血30分钟的小鼠，左肾的荧光强度在5分钟内增加到峰值，然后降低，下降的速度比假手术组慢，左肾和右肾的荧光强度比逐渐增加到1.3，这是由于缺血引起的左肾损伤，导致肾脏清除缓慢；对于缺血60分钟的小鼠，左肾的荧光强度在注射后10分钟达到max值，随后降低，与缺血30分钟相比，荧光强度下降的速度更慢，左肾与右肾的荧光强度比逐渐增加到2.2，表明缺血肾的清除率进一步减慢。这些结果表明，肾缺血时间越长，肾脏在注射au ncs后达到m荧光的时间越长以及左肾和右肾的荧光之间的差异越大。随着成像时间的增加，缺血性肾脏的sbr逐渐高于非缺血性肾脏（图4e）。
图4. （a）rir小鼠模型的构建和rir小鼠nir-ii荧光成像的时间线的示意图。（b）静脉注射mha/cystm-au ncs后rir小鼠在不同时间点的nir-ii荧光成像。（c） 注射mha/cystm-au ncs后缺血肾脏荧光强度的变化（*p＜0.05，**p＜0.01）。（d）rir小鼠左肾和右肾的荧光强度比。（e）sbr用于静脉注射mha/cystm-au ncs后不同时间点rir小鼠缺血性肾脏的荧光成像。
uuo法常用于肾间质纤维化模型的制备。梗阻后，尿液潴留压迫肾小管，导致肾小管上皮细胞进行性坏死，间质急慢性炎细胞浸润，坏死的肾小管组织逐渐被纤维瘢痕取代，最终形成进行性肾间质纤维化。作者通过外科缝线完quan结扎小鼠左输尿管建立uuo模型。结扎一段时间后，将mha/cystm-au ncs静脉注射到小鼠中，并在注射后的不同时间点进行nir-ii荧光成像（图5a）。如图5b所示，在注射后5分钟检测到肾脏中的nir-ii发光信号，并随着时间的推移逐渐减弱。在接受输尿管结扎0分钟和30分钟的小鼠中，左肾和右肾的信号之间没有观察到明显的差异；在接受输尿管结扎24小时的小鼠中，左肾的荧光显著低于右肾（图5c），且左肾的sbr低于右肾的sbr（图5d）。表明输尿管结扎24小时会导致肾滤过异常，结扎30分钟则无显著影响。
此外，作者还对两组模型分别进行了h&e染色分析验证肾损伤情况。结果显示，使用uuo模型的实验中，与假手术组的肾脏相比，uuo 24小时后，肾脏肾小管轻度扩张，肾小管上皮细胞少量坏死脱落，证实了uuo 24 小时诱导的轻微肾损伤。而在使用rir诱导的肾损伤模型的实验中，与未缺血的小鼠相比，缺血60min的小鼠的肾脏结构出现了一些明显的损伤，表明60min的夹闭导致了严重的肾损伤。该结果与荧光成像结果一致，因为缺血60分钟的小鼠观察到蕞高荧光信号的时间晚于uuo 24小时的小鼠（图4b, 5b）。这说明所制备的au-ncs能够区分不同的肾损伤情况，验证了au-ncs对肾功能障碍成像的能力。
图5. （a）uuo小鼠模型的建立和nir-ii荧光成像的示意图。（b）输尿管结扎0分钟、30分钟和24小时的uuo小鼠静脉注射mha/cystm-au ncs后的nir-ii荧光成像。（c）沿图中黄线的横截面荧光强度图。（d）注射mha/cystm-au ncs后5分钟，不同结扎时间的uuo小鼠肾脏荧光成像的sbr。
总之，本研究成功合成了一系列具有nir-ii激发和发射的双配体稳定的au ncs，可用于体内rir和uuo诱导的肾功能障碍的高分辨率荧光成像。与以往的肾功能nir-ii成像相比，在nir-ii激发下的荧光成像可以更清晰地显示肾脏，实现对肾功能障碍的更准确诊断，为肾功能障碍的高分辨率精确成像提供了有力的工具。
参考文献
yi, s.; hu, q.; chi, y.; qu, h.; xiao, y., bright and renal-clearable au nanoclusters with nir-iiexcitation and emission for high-resolution fluorescence imaging of kidney dysfunction. acs materials letters 2023, 5 (8), 2164-2173.
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