--细 胞 基 本 信 息---
细胞名称： nk-92mi(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者nk细胞)
细胞别称： nk-92mi mi; nk-92mi mi; nk92-mi; nk92mi; nk-92mi transfected with mfg-hil2
细胞货号： snl-195
生长特性： 悬浮
培养条件： 1640+10% fbs+1% p/s
培养环境： 空气，95%； 二氧化碳 (co2)，5%；37℃
细胞简介： nk-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株il-2依赖型nk细胞株。nk-92mi细胞是转染得到的源自nk-92细胞的il-2非依赖的nk细胞株，亲本细胞nk-92通过微粒体基因转化法用逆转录病毒mfg-hil-2载体携带的人il-2cdna进行转化，可能由于载体整合到基因组dna中，转化是稳定的。nk-92mi细胞细胞对很多恶性细胞有细胞毒性；铬释放试验显示它能杀死k562细胞和daudi细胞。nk-92细胞有以下特征：cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45、cd54表面标记阳性；cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23、cd34和hla-dr表面标记阴性。nk-92mi细胞和nk-92ci细胞这两个变种都包含、表达并合成hil-2cdna。nk-92mi细胞合成的il-2水平比nk-92ci高，而亲本细胞不合成表达。1998年9月提交到atcc的培养物污染了支原体，其后代通过bm细胞周期蛋白处理21天消除支原体，处理后6周，用hoechst染色、pcr和标准培养测试进行支原体检测，结果都呈阴性。
细胞正常生长形态照片
nk-92mi细胞培养注意事项
lnk-92mi细胞呈聚团悬浮生长，细胞团较大时需要吹打成小团，防止团块中间的细胞因营养不足而死亡。除非实验需要，不建议经常将细胞吹散成单个细胞，否则细胞状态将变差；
lnk-92mi细胞对血清要求高，应该使用优质血清进行培养；
lnk-92mi细胞对吹打等机械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度轻柔；
lnk-92mi细胞对温度敏感，培养基、pbs需复温至37℃再使用。
lnk-92mi细胞冻存难度较大，建议使用90% fbs+10%dmso冻存液，冻存密度推荐300万细胞/毫升，不能过低。冻存时细胞应吹散成单细胞。
l复苏时建议将血清浓度提高至20%，待细胞可以正常聚集生长后再将血清浓度恢复至10%
lnk-92mi细胞计数时算得的细胞的活率不能代表该细胞真实的状态。因为培养时存在一些散在的单细胞，这些细胞活性较低，且不能完*去除，导致在计数时细胞整体活率可能不高。细胞状态可以通过细胞能否聚团判断：只要大部分细胞能聚团生长，细胞状态就没有问题。当细胞状态不佳时，细胞无法顺利聚团。
l当细胞状态不佳时，向培养基中按100-200u/ml补充il-2，可有效改善。
nk-92mi细胞换液方法
l半换液法：
1.准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
2.将培养瓶竖立静置一段时间，待细胞沉底；（肉眼观察细胞沉底情况）
3.吸头紧贴液面，小心吸出一半的培养基，转移到离心管；
4.900-1000rpm 3min离心，离心管里若有细胞，则用新鲜培养基重悬后放回原瓶；
5.原瓶补充一半的新鲜培养基。
tips：建议半换液2-3次后进行离心换液。
l离心换液法：
1.准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
2.将所有细胞悬液转移至离心管中；
3.900-1000rpm，3min离心；
4.弃上清，加5ml pbs轻轻重悬细胞进行润洗，再900-1000rpm，3min离心；
tips：此处pbs润洗是为了去除细胞碎片，平时培养若细胞碎片不多可以忽略此步骤。
5.培养瓶中加入适量新鲜培养基；
6.离心完成后弃上清，加适量新鲜培养基轻轻重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种回培养瓶中，混匀细胞，放入培养箱中继续培养。
nk-92mi细胞传代方法
l离心法：
1.准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）
2.用移液器吸取培养瓶内细胞悬液转移至离心管中；
3.900-1000rpm，3min离心收集细胞；
4.在培养瓶中加入适量新鲜培养基；（t25推荐10ml，t75推荐20ml）
5.离心完成后，弃离心管内上清，然后加入适量新鲜培养基，轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。
l直接分瓶法：
1.轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分散；若有较大的细胞团，需吹散成小团。
2.用移液器吸取培养瓶内细胞悬液，均分到若干个新培养瓶中，每瓶再补充适量的新鲜培养基，轻轻混匀后将细胞放入培养箱中继续培养。
tips：
l注意控制吹打力度尽可能轻柔和离心转速以及时间不要过高，避免细胞受机械损伤。
l传代比例推荐1：2
nk-92mi细胞冻存方法
1.准备所需的培养基、pbs、血清、dmso、离心管以及无菌枪头等；（试剂需提前预热）
tips：若冻存前培养基已经变黄，先换液静置培养4h左右，待细胞活力稳定后再进行冻存。
2.根据收集到细胞量，配制相应量的冻存液，并准备相应数量的冻存管，在冻存管上标志细胞名称，代次，冻存时间等信息。推荐冻存液配方：90%fbs+10%dmso；冻存密度300万细胞/ml/管。
tips：冻存密度过低将导致复苏后状态不佳。
3.将细胞悬液转移至离心管中1000rpm，3min离心收集细胞；
4.离心完成后弃上清，加入相应量的配置好的冻存液轻轻重悬混匀细胞，将细胞悬液分装至冻存管中。注意吹打力度，不要产生过多气泡；
tips：加入冻存液混匀细胞后及时分装并将细胞降温冻存，以减少dmso对细胞的毒性。
5.将细胞放置程序降温冻存盒中，再将冻存盒转移至-80℃冰箱进行降温冻存。
6.次日（16h-24h后）复苏一管检查冻存效果，确认没问题后及时将冻存细胞放置液氮中保存，细胞在-80℃冰箱放置时间不要超过3天。
nk-92mi细胞复苏方法
1.提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；
2.将冻存细胞从液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速摇晃至完*融化，融化时间不超过2min；
tips：
l若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。
l水浴时使用一次性pe手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。
3.直接将冻存管900-1000rpm 2min离心，同时在培养瓶中加入适量新鲜培养基；
4.离心完成后弃上清，吸取1ml新鲜培养基（建议血清浓度提高至20%）轻轻重悬细胞，吹散细胞后接种到培养瓶中；
5.使用十字法或8字法将细胞混匀后置于培养箱中培养。
tips：整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。
nk-92mi细胞收货攻略
1.拆封包装盒，确认细胞，说明书等是否齐全，收货细胞名与所购买细胞是否符合；
2.观察细胞培养瓶是否完好，有无漏液，培养瓶内培养基是否有肉眼可见的絮状物或者浑浊等，发现异常及时拍照联系销售人员；
3.确认无异常后，将培养瓶表面消毒，然后撕掉封口膜竖立放入培养箱平衡4h左右，让悬浮细胞沉下培养瓶底部；
4.平衡过程中可以仔细阅读细胞说明书，知悉细胞所需培养体系，培养环境以及培养注意事项等；
5.平衡完成后竖立取出细胞培养瓶，此时大部分细胞沉在培养瓶底部，小心吸取上清至离心管中，保留10ml左右培养基在培养瓶内，小心操作，尽量不要吸到沉在底部的细胞；
6.将离心管1200rpm，5min离心收集未沉下培养瓶底部的细胞，上清可以4℃保存，后续用于培养细胞，以平稳过度到自己的培养基。将收集到的细胞接种至原培养瓶；
7.观察细胞，根据细胞状态，以及团块数量、大小决定传代或继续培养。
常见问题及解决方案
培养过程中细胞碎片较多怎么处理？
1.细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。
2.细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可通过900-1000rpm，3min离心以去除部分碎片。少量碎片不影响细胞生长，不建议频繁离心。
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