ics 67.100.10x 04gb/t 18980-2003乳和乳粉中黄曲霉**m,的测定**亲和层析净化效液相色谱法和 荧 光 光 度 法determination of aflatoxin m1 content in milk and milk powder-cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination byhig h- pe rformancel iquidc hromatigraphya ndf luorometer(iso 14501:1998，idt)2003-02-21发布2003-08-01实施中华人民共和发布gb/t 18980-2003前言本标 准 的 **亲和层析净化效液相色谱法等同采用iso1 4501;1998《乳和乳粉中黄曲霉**m **亲和层析净化效液相色谱法》。本标 准 免 疫亲和层析净化荧光光度法快速测定乳和乳粉中黄曲霉**m,o本标 准 中 的附录a为资料性附录本标 准 由 北京市提出。本标 准 由 全食品工业标准化技术委员会归口。本标 准 起 草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出人境检验、标准物质研究中心。本标 准 主 要起草人:晶、张鹏、张艺兵、邵明武。本标 准 为 次发布。gb/t 18980-2003乳和乳粉中黄曲霉**m,的测定**亲和层析净化效液相色谱法和荧 光 光 度 法**亲和层析净化效液相色谱法1. 1 范围本标 准 适 用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉**m,含量的测定。乳粉中的低检测限是。.08 pg/kg，乳中的低检测限是。.008 pg/l1.2 术语和定义下列 术 语 和定义适用于本标准。1.2. 1黄曲 碑 毒 索m，含， at7atoxinm ,co ntent通过 本 标 准所测定出的本物质的质量含量。注 :黄 曲 霉**m、的含量以微克/升伽g/l)或微克/千克(fig/kg)表示。1. 3 原理试样 通 过 **亲和柱时，黄曲霉**m 被提取。亲和柱内含有的黄曲霉**m、特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉**m,(抗原)键合，形成抗体抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉**m,，收集洗脱液。用带有荧光检测器的效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉**m,含量1.4 试荆除非 特 别 声明，所用试剂为分析纯;使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。1.4.1 **亲和柱:应该含有黄曲霉**m 的抗体。亲和柱的大容量不小于100 ng黄曲霉**m,(相当于50 ml浓度为2 pg/l的试样)，当标准溶液含有4 ng黄曲霉**m,(相当于50 ml浓度为80 ng/l的试样)时回收率不低于80 。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱至少检查次(见1.4.1.1和1.4.1.2)1.4.1.1 柱效检查用移 液 管 (1.5.4)移取1.0m 工_的黄曲霉**m,储备液(1.4.5.2)到20m l的锥形试管中(1.5.9)。用恒流的氮气(1.4.3)将液体慢慢吹干，然后用10 ml. 10%的乙睛(1.4. 2.2)溶解残渣，用力摇荡。将该 溶 液 加人到40m l的水中，充分混匀，全部通过**亲和柱。按说明书要求使用**亲和柱。淋洗**亲和柱后，洗脱下黄曲霉**m,。将洗脱液进行适当稀释后，用效液相色谱仪测定**亲和柱键合的黄曲霉**m,含量。计算 黄 曲 霉**m,的回收率，将其结果与1.4.1中所要求的指标进行比较。1.4.1.2 回收率检查用移 液 管 (1.5们移取。.8 m l。005p g/ml的黄曲霉**ml标准工作液(1.4.5.3)到10m l的水中，充分混匀，全部通过**亲和柱。按说明书使用**亲和柱。淋洗**亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素m:。将洗脱液进行适当稀释后，用效液相色谱仪测定**亲和柱键合的黄曲霉**m，含量。计gb/t 18980-2003算黄曲霉**m，的回收率，将其结果与1.4. 1中所要求的指标进行对比。1.4.2 乙睛:色谱1.4.2.1 25%乙睛水溶液:将250m l的乙睛(1.4.2)与750m l的水混溶(使用前需要脱气)。1.4.2.2 10%乙睛水溶液:将100m l的乙睛(1.4.2)与900m l的水混溶(使用前需要脱气)。1.4.3 氮气。1.4.4 三抓甲烷:加人。.5%^-1.0%质量比(与三抓甲烷质量比)的乙醇进行稳定。1.4.5 黄曲霉**m:标准溶液1.4.5. 1 校准溶液m:三抓甲烷溶液标称浓度为10p g/ml。根据下面的方法，在大吸收波段处测定溶液的吸光度，以确定黄曲霉**m,的实际浓度。用分 光 光 度计(1.5.11)在340n m^-370n m处测定，扣除三抓甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸光度值。在接近360 nm大吸收波段a、处，测得吸光度值为a，根据式(1)计算出浓度值c, (pg/ml),..‘ = a x m x 1 00 /e · ··· ··· ·· ·· ··· ··· ··· ··· ··· ··· · ··· ·⋯ ⋯ ( 1 )式 中 :a— 在 3m.:处测得的吸光度值;m- - 32 8g /mol，黄曲霉**m,摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol);e- 19 95,溶于三抓甲烷中的黄曲霉**m,的吸光系数，单位为平方米每摩尔(m'/m ol),1.4.5.2 标准储备液确定 黄 曲 霉**m;标准溶液的实际浓度值后(1.4.5.)1，继续用三抓甲烷将其稀释至浓度为0.1 u g/mi的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个月。两个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。1.4.5.3 黄曲霉**m,标准工作液从冰 箱 中 取出储备液(1.4.5.2)放置至室温，移取定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液当天使用当天制备。m，标准工作液配制:用移液管(1.5. 4) 准确移取1.0 m l的储备液(1.4. 5. 2)到20m l的锥形试管中(1.5.9)，用和缓的氮气(1.4.3)将溶液吹干，然后用20.0 m l1 0%的乙睛(1.4.2.2)将残渣重新溶解，30m in内振摇、混匀，配成浓度为。.00 5j g/mi的黄曲霉**m;标准工作液。在用氮气对储备液吹干的过程中，定要仔细操作，不能让温度降低太多而出现结露。在作 标 准 曲线时，黄曲霉**m，的进样量分别为。.05n g,0.1 n g,0.2 n g和。.4 n g。根据效液相色谱仪进样环的容积量，用工作液配制系列适当浓度的黄曲霉**m,标准溶液，稀释液用10%乙睛(1.4.2.2)5 仪骼及材料便用 实验室通用仪器设备，特殊仪器及材料说明如下1,5. 11.5.21.5.31.5.41.5.51.5.61.5.71.5.81.5.91.5. 10次性注射器:10 ml和50 ml,真空系统。离心机:40 00g 离心力(离心力g=1.12 x 1 0-,x 转/分x旋转半径)。移液管:1.0m l,2.0 m l和50.0 m l,玻璃烧杯:250 mlo容量瓶:100 mle水浴滤纸:温控30℃士2',50℃士20c,温度范围350c---370c,带刻度的磨口锥形玻璃试管:5 ml,10 ml,20 mi。效液相色谱仪gb/t 18980-20031.5. 10.1 无脉冲泵:适合恒定体积流量约1 ml/min的泵1.5. 10.2 进样系统:具有固定或可变容积的进样环，进样体积50川--500 pl.1.5. 10.3 反相色谱柱:填充3 um或者5 km的十八烷基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。1.5. 10 .4 荧光检测器:具有365n m激发波长、435n m发射波长，在适当的色谱条件下能够测定0. 02 ng的黄曲霉**m,(相当于5倍噪音)。1.5. 10.5 记录仪:带打印机或绘图仪、电子积分仪或计算机数据处理系统。1.5. 1 1 分光光度计:波长范围为200n m--400n m，带光径长度为1c m的石英比色池。1.5. 12 天平:准确至。.1g，小分度。.01 go1.6 采样采样 方 法 不属于本标准叙述的范围，推荐的采样方法请参见iso7 07[1]a实验 室 收 到的样品应该具有真正的代表性，在运输和储藏的过程中没有被损坏和改变。1.7 分析步骤1.7. 1 概述所有 的操 作分析均应尽可能在避光条件下进行。使用 不 同 厂商的亲和柱，在乳粉的制作、洗涤和洗脱的操作方面可能略有不同，应该严格按照说明书要求进行操作。通常的分析步骤包括:用水或者盐水缓冲液将乳粉冲制成乳，离心分离后在定压力过柱(可能需要预洗)，用水洗柱，并用甲醇或乙睛洗脱吸附在柱上黄曲霉**m,。严格按照规定的流速进行操作。1.7.2 制备试样1.7.2. 1 乳将乳 样 品 在水浴(1.5 .7) 中加热到350c-370c。用滤纸(1.5.8)过滤(根据情况，也许需要用几张滤纸进行过滤)，或者在4 000 g离心力下离心15 min。至少收集50 ml乳试样，按照1.7.4继续进行分析。1.7.2.2 乳粉称取 10 g样品(到0.1 g ),置于250m l的烧杯(1.5.5)中。将50m l已预热到50℃的水多次少量地加人到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果 乳 粉 不能*溶解，将烧杯在50℃的水浴(1.5. 7)中放置至少30m in，仔细混匀。将溶 解 的 乳粉冷却至20℃后，移人100m l容量瓶(1.5.6 ) 中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液并移人容量瓶中，再用水定容至刻度。用滤纸(1.5.8)过滤乳，或者在4 000 g离心力下离心15 min,至少收集50 ml_的乳试样，按照1.7.4继续进行分析。1.7.3 **亲和柱的准备将 次 性 的50m l注射器筒(1.5.1)与亲和柱(1.4.1)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统(1.5.2)连接起来。，.7.4 样品的提取与纯化用移 液 管 移取50m l试样(1.7.2.1或1.7.2.2)到50m l注射器(1.5.1)中，调节真空系统(1.5.2),控制试样以zm工min-3 ml/min稳定的流速过柱。取下 50 m i的注射器，装上10m l注射器。注射器内加人10m i水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱 开真 空 系统，装上另个10m l注射器，加人4m l乙睛(1.4.2),缓缓推动注射器栓塞，通过柱塞控制流速，洗脱黄曲霉**m,，洗脱液收集在锥形管(1.5.9)中，洗脱时间不少于60 s。然后用和缓的氮气(1.4.3)在30℃下将洗脱液蒸发至体积v。为50 1,l-500 pl(警告:如果蒸发至干，会损失黄曲霉**m,)。用水将v。稀释10倍至终体积为v,(即500 pl-5 000 vi)。注:如果注人效液相色谱仪含黄曲霉**m 的样品，乙睛含量超过10肠，色谱峰变宽。如果水含量超过90%则 对 色 谱峰的形状没有影响。cs/t 18980-20031.7.5 效液相色谱分析仪1. 7.5.1 泵以t ra定 流 速 将 乙睛水溶液(1.4.2.1)泵流通过效液相色潜柱。如果需要(根据所用色谱柱的型号)，调整乙睛水的比例，以保证使黄曲霉**m,与其他成分的分离效果。乙睛 水 溶 液 (1.4.2.1)的体积流速根据所用色谱柱(1.5. 10 .3 ) 而定对于普通色谱柱(柱长约25 cm,柱内径约4. 6 mm)而言，流速在1 ml-/min左右，效果好;柱内径为3 mm时，流速在。.5 ml·min左右，效果好为 了确 定 的色谱条件，好先将不含黄曲霉**m,的阴性样品提取液注人hplc，然后再注人样品提取液与黄曲霉**m 标准溶液的混合液1.7.5.2 色谱性能标准 曲 线 的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地注人固定量的黄曲霉**m,标准溶液，直至获得稳定的峰面积和峰。相邻两次峰面积和峰的差异不得超过5%em，的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。每隔段时间测定固定量的黄曲霉**m，标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。1.7.5.3 黄曲.毒索m:的标准曲线根据 hp lc进样环容积，选择适当体积数v,，分别注人含有。.05n g,0.1 n g,0.2n g和0.4 n g的黄曲霉**m 标准溶液。绘制成峰面积或峰对黄曲霉**m,质量数的标准曲线。1.7.5.4 样品洗脱液的色谱分析及进样方案通过 进 样 环将适量体积v.洗脱液注人效液相色谱仪。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出洗脱液中的黄曲霉**m,。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当连续检测系列样品时，建议每隔五个样品，加测个黄曲霉**m,标准溶液。根 据 样 品洗脱液色谱图中黄曲霉**m,的峰或峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所含有的黄曲霉**m 质量数(ng).如果 样 品 洗脱液的黄曲霉**m,的峰面积或峰值于标准溶液，用水定容稀释样品洗脱液后，重新进样分析。1.8 测定结果的计算与表示1.8. 1 乳应用 式 ( 2)计算被测样品中的黄曲霉**m,的含量wmewm = m nx ( v, /v )x ( 1/ v) ··· ··· ··· ···· ··· ···· ··· ···· ⋯ ⋯ (2 )式 中 :w 下 黄 曲霉**m的含量，单位为微克每升(pg/1.);ma - 样品洗脱液黄曲霉**m 的峰面积或峰从标准曲线上得出的黄曲霉**m 的质量数， 单 位 为纳 克 ( ng );v; 止 样 品洗脱液的体积数，单位为微升(f4l);v - 样 品洗脱液的终体积数，单位为微升(川_);v- 通 过 免 疫亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升(ml)o计 算结 果 表示到小数点后三位。1.8.2 叨姗应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉**m，的含量woow。m x(v/v.)x (1/m) ···························⋯⋯(3)w=c'l-p- 样品中的黄曲霉**m，的含量，单位为微克每千克((lg/kg);50 ml样液(7.4)中所含有的乳粉质量数，单位为克(g);gb/t 18980-2003mn ,v,,vi的含义与1.8.1中所定义的样。式( 3)适用于未经稀释的试样，否则应该乘以稀释倍数。计 算结果表示到小数点后三位。9 精密度各 实验室试验结果的精密度总结于附录a中，这些数据不适用于其他的浓度范围和材质。10 测试报告测 试报告中应该含有:a) 描述样品完整特征所需要的所有信息;b) 采样方法，如果知道请写上;。) 根据该标准，所采用的试验方法;d) 该标准没有提出的其他操作细节，对测试结果可能产生影响的操作、现象以及采取的措施e) 测试结果;f) 如果检查了重复性，终的验证结果。2 **亲和层析净化荧光光度法尽21 范围本方 法 规 定了用**亲和层析净化荧光光度法测定乳和乳粉中黄曲霉**m,的条件和详细分析步 骤。本 方 法 适 用 于乳和乳粉中黄曲霉**m 的快速测定。乳中黄曲霉**m:的检出限为0. 1 pg/l，乳粉中黄曲霉**m，的检出限为。.l pg/kgo22 方法提要试样 经 过 离心、脱脂、过滤后，滤液经过含有黄曲霉**m,特异性单克隆抗体的**亲和层析净化，黄曲霉**m，交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉**m,具有专性，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与所有存在的黄曲霉**m (抗原)键合。用甲醇水(10+90)将**亲和柱上杂质除去，以甲醇水(80+20)通过**亲和柱洗脱，加人澳溶液衍生后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉**m，含量。23 试剂除非 另有 规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。2.3. 1 甲醇(ch,oh):色谱纯。2.3.2 抓化钠(naci),2. 3. 3 甲醇水(10+90):取10 ml甲醇加人90 ml_水2.3 .4 .甲醇水(80+20):取80m l甲醇加人20m l水。2.3.5 澳溶液储备液(0.01%):称取适量澳，溶于水后，配成。01%的储备液，避光保存。2.3.6 嗅溶液工作液(0.00200):取10m l0 .01 %的嗅溶液加人40m l水混匀，于棕色瓶中保存备用现用现配。2.3.7 水硫酸奎宁(c,oh z,n zo z·h2s 04·2h20).2.3. 8 硫酸溶液(0.05 m ol/l):取2.8m l浓硫酸，缓慢加人适量水中，冷却后定容至10 00m l。2.3. 9 荧光光度计校准溶液:称取0.34 0g 硫酸奎宁(c2oh 24n 20 2·h2s认·2h20)，用0.05m ol/l硫酸溶液溶解并定容至100m l，此溶液荧光光度计读数相当于2.0 p g/l黄曲霉**m,标准溶液。0.05 m ol/i硫酸溶液荧光光度计读数相当于0.0 f ag/l黄曲霉**m-2.4 仪器2.4. 1 荧光光度计2.4. 2 离心机:离心力不低于40 00r /mingb/t 18980-20032.4.3 玻璃纤维滤纸:直径11 cm，孔径1.5 pme2.4.4 黄曲霉**m，**亲和柱。2.4.5 空气压力泵。2.4.6 玻璃试管:直径12 mm.长75 mm，无荧光特性。2.4. 7 玻璃注射器。2.5 分析步甄2.5. 1 样品提取2.5.1.1 乳取 50 m l乳样品，加人1.0 g 抓化钠，40 00r /min离心力下离心10m in，小心移取用于分析的乳底层脱脂部分，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。2.5.1.2 乳粉称取 5.0 g 乳粉，用30`c^ -60℃水将其慢慢溶解，定容为50m l，加人1.0 g 抓化钠，以下按2.5.1.1的步骤操作。2.5.2 净化将免 疫 亲 和柱连接于10m l玻璃注射器下。准确移取10.0 m l上述滤液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml/min流速缓慢通过**亲和柱，直至2 ml-3 ml空气通过柱体。以10 ml甲醉水(10+90)清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 ml-3 ml空气通过柱体。准确加人1.0 rnl(v,)甲醇水(80十20)洗脱液洗脱，流速为1 ml/min-2 ml/min，收集全部甲醉水洗脱液于玻璃试管中，备用。2.5.3 测定2.5.3. 1 荧光光度计校准在激 发 波 长360n m.发射波长450n m条件下，以。.05m ol/1硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0 la g/l;以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为2.0 la g/l,2.5.3.2 样液测定取上 述 洗 脱液加人1.0m l(v)0.002%澳溶液，1m in后立即于荧光光度计测定样液中黄曲称**m，含量c,2.5.3.3 空白试验用 水 代 替试样，按2.5 .1^-2.5 .3 步骤做空白试验。2.6 结.计算2.6. 1 乳乳检 测 结 果按式(4)计算:x,= (c，co) xv,x10v · ·. ······。，·····..·····.··⋯⋯(4)式中:x,-试样中黄曲霉**m，含量，单位为微克每升(ph/l);cl-— 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉**m:的浓度，单位为微克每升(k4/l);ca-- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉**m:的浓度，单位为微克每升(kb/l);v,-— 终净化甲醇水洗脱液体积，单位为毫升(ml) ;v--通过亲和柱试样体积，单位为毫升(ml) ;10仪器的读数系数。计算结果表示到小数点后位。gb/t 18980-20032.6.2 乳粉乳粉 检 测 结果按式(5)计算:x，(c2co x v, x 10仇义v ··················。·········⋯ ⋯(5)式中:xz— 试样中黄曲橄**m、含量，单位为微克每千克(fig/kg);ci- 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉**m、的浓度，单位为微克每升如g/l;ca- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉**m,的浓度，单位为微克每升伽g/l);叭— 终净化甲醉水洗脱液体积，单位为毫升(ml;v— 通过亲和柱试样体积，单位为毫升(ml) ;m- 50 ml试样中所含乳粉的质量数，单位为克每毫升(g/ml) ;10— 仪器的读数系数。计算结果表示到小数点后位。gb/t 18980--2003附 录 a(资 料 性 附 录 )多个不同实验室的试验结果世 界各 地 16个实验室参加了低脂肪(i%)和脂肪(28 )乳粉样品的协同试验。脂肪样品是用于制作参比物质的剩留物[4口，所以黄曲霉**m,的含量是已知的。对于 乳 粉 ，其污染水平为。08p g/kg--0.6 p g/kg，即对于乳而言，污染水平为8n g/l-60n g/i.试验 结 果 根据iso 5725-1和iso 5725-2仁2;3〕规定的统计方法获得，其精密度的数据列于表a.1(注:试验数据来自于参考文献「5〕和「6]).表 a .1 箱 密 度 数 据样品编号1 2 3 4 5实验室个数12 4 l3 11 14平均值/(ng/kg) 81 150 80 202 580重复性值。/(ng/kg) 23 60. 1 15 27 203再现性值r/(ng/kg) 52 98 41 61 310重复性变异系数/(%) 9. 9 14.0 6. 8 4. 7 12. 5复验性变异系数/(写) 23 22. 7 18. 3 10.8 19. 1减少的实验室数是根据cochran和grubbs统计方法应该从样本中剔除的数据
上海嘉鹏科技有限公司专业生产：紫外分析仪、三用紫外分析仪、暗箱式紫外分析仪、暗箱三用紫外分析仪、暗箱紫外分析仪、手提式紫外分析仪、三用紫外分析仪暗箱式、紫外检测仪、部分收集器、恒流泵、蠕动泵、凝胶成像系统、凝胶成像分析系统、化学发光成像分析系统、光化学反应仪、旋涡混合器、漩涡混合器、玻璃层析柱、梯度混合器、梯度混合仪、核酸蛋白检测仪、玻璃层析柱、荧光增白剂测定仪、馏分收集器、切胶仪、蓝光切胶仪、层析系统等产品。欢迎。
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