α-半乳糖苷酶（α-gal）活性检测试剂盒说明书
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货号：100t/48s
产品内容：
提取液：液体 100ml×1 瓶，4℃保存。
微量法
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 2.5ml 双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体 4ml×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 15ml×1 瓶，4℃保存。
标准液：液体 1ml×1 支，4℃保存，5μmol/ml 对硝基苯酚溶液。
产品说明：
α-gal (ec 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-gal
对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 d-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-gal 分解对-硝基苯-α-d-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-gal 活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：称取约 0.2g 组织，加入 1ml 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟， 取上清，置冰上待测。
3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml.
二、测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。
2、样本测定，（在 ep 管或 96 孔板中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μl）
测定管
对照管
标准管
试剂一
25
蒸馏水
25
试剂二
35
35
样本
10
10
迅速混匀，放入 37℃保温 30min
标准液
70
试剂三
130
130
130
充分混匀， 400nm 处测定吸光值 a，计算δa=a 测定-a 对照。每个测定管需设一个对照管。三、α-gal 活性计算：
根据标准管的吸光度（x，减去浓度为 0 的标准管 od 值）和浓度（y，nmol/ml）建立标准曲线，将△a 带入标准曲线中，计算样品生成的产物量（nmol/ml）。
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-gal 活力(nmol/h /mg prot)=(y×v 反总)÷(v 样×cpr)÷t=14×y÷cpr 需要另外测定，建议使用本公司 bca 蛋白质含量测定试剂盒。
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-gal 活力(nmol/h /g 鲜重)＝(y×v 反总)÷(w×v 样÷v 样总)÷t=14×y ÷w
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-gal 活力(nmol/h /104 cell)= (y×v 反总)÷(500×v 样÷v 样总)÷t=0.028×y
cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；v 反总：反应体系总体积，0.07ml；v 样：加入反应体系中样本体积，0.01ml；v 样总：加入提取液体积，1ml；w：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数， 500 万；t：反应时间，0.5h。
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