在兰州液相色谱仪是属于易学难用的仪器，特别讲究“正确使用”和经验。液相工作者接触较多的是流动相，也就是流动相，是造成兰州液相色谱各种问题的主要源头。
液相色谱仪常见的故障之一是堵
接下来先聊聊“堵”的情况。“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，其主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。
“堵”的原因之一：配制流动相时细菌污染
首先，我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。
新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。这里有两种方式推荐：
（1）理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。其有一个缺点就是价格不菲。
（2）成箱购买市售品牌纯净水，如，500ml一支的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2元左右。
※这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到后来有一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步可以也应当去除。
原因有以下三点：
（1）流动相过滤在理论上有好处，但是，实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。
（2）流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器*是比较容易损坏的设备。重要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。
（3）流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。
（4）在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。
“堵”的原因之二：使用流动相时的细菌污染。
指的是：
流动相刚开始没有长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。
举个简单的例子：
50％的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路a放纯甲醇，流路b放纯水。
从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性好的实验效果。
但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌（很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是很好的肥料，细菌长得更迅速），一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。
所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10％的甲醇水代替纯水溶液（以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5％就基本可以了，在10％及以上就可以了），这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。
“堵”的原因之三：不适当操作。
常见问题的有以下几种：
（1）在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。
（2）样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。
（3）在使用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成了死堵，压力快速升高超过警戒值。
（4）在使用金属管路作出废液管时，应当注意在废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液，在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。
“堵”的原因讲了不少，现介绍查堵的方法。
在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。
查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件（柱子除外）装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。
1.流动相须用hplc级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45μm或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如，甲醇等)，因为，纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.c18柱不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗，清洗方法：
①以异丙醇作溶剂冲洗；
②放在异丙醇中间用声波清洗；
③用10％稀硝酸清洗；
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
11.要注意柱子的ph值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的
流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
常见故障断定及解决方法
(一)保留时间变化
1.柱温变化：柱恒温，需要时需配置恒温箱
2.等度与梯度间未能充分平衡：至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够：用》25mmol/l的缓冲液
4.柱污染：每天冲洗柱
5.柱内条件变化：稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命：采用保护柱
(二)保留时间缩短
1.流速增加：检查泵,重新设定流速
2.样品超载：降低样品量
3.键合相流失：流动相ph值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加：柱恒温
(三)保留时间延长
1.流速下降：管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化：用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失：同前(二)3
4.流动相组成变化：同前(二)4
5.温度降低：同前(二)5
(四) 出现肩峰或分*
1.样品体积过大：用流动相配样,总的样品体积小于峰的15%
2.样品溶剂过强：采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道：更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效：更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏：更换进样器转子
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰：每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物：处理样品
3.柱未平衡：重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三(tfa)氧化(肽谱) ：每天新配
5.水污染(反相) ：通过变化平衡时间检查水质量，用hplc级的水
(六) 基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气：加柱后背压
2.污染(随机噪声) ：清洗柱,净化样品,用hplc级试剂
3.检测器灯连续噪声：更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) ：采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡：流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
1.柱超载：降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰：清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用：
加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相ph值,钝化样品
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大：
连接点降至低处,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降：
用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
1.进样体积过大：同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展l进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣峰半宽的10%
5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至很小
9.样品过载:进小浓度小体积样品