文献背景
植物受到环境刺激时会释放挥发性化合物（vocs）作为植物间的特殊沟通信号而被感知，进而诱导邻近植物产生防御反应，这种现象被称为气传性免疫（airborne defense，ad）。尽管几十年来在众多植物中已观察到这种植物间通讯（ppc）现象，并了解其生物学、生态学意义，然而包括ad在内的vocs介导的ppc的分子机制仍不清楚。此外，除乙烯受体外，植物中介导voc传感系统的受体也一直未确定。
蚜虫是具破坏性的农业和园艺害虫，以韧皮部为食，超过40%的植物病毒依靠蚜虫传播来感染植物，因此对作物生产造成了大规模的破坏。蚜虫侵害会诱导植物释放包含水杨酸甲酯（mesa）、水杨酸结合蛋白-2（sabp2）、转录因子nac2和水杨酸-羧甲基转移酶-1（samt1）在内的vocs。mesa在植物防御蚜虫等草食性昆虫侵害中发挥重要作用，包括驱除昆虫、吸引捕食者或降低昆虫的生存适应性等方式。mesa被认为是植物内部和长距离移动信号，参与诱导对微生物病原体和食草昆虫的系统获得性抗性（sar）。在sar过程中，水杨酸（sa）在病原体感染的细胞中积累，并通过samt1转化为mesa；然后，mesa通过韧皮部进入远端组织，随后在未侵染叶中被sabp2重新转化为sa。虽然已知mesa作为植物内sar信号的功能，但mesa如何作为植物间通讯的信号激活ad抗蚜虫防御是一个长期未解决的问题。植物是否拥有识别和感知空气中mesa的受体也不清楚。此外，蚜虫和病毒能否干扰植物气传性免疫也未知。本研究揭示了ad的分子机制和蚜虫-病毒共同进化的共生关系，证明ad是控制蚜虫和病毒的潜在仿生策略。
基本信息
题目：molecular basis of methyl-salicylatemediated plant airborne defence
期刊：
nature
影响因子：64.8
通讯作者：
刘玉乐
作者单位：
清华大学等
索莱宝合作产品：
产品货号
产品名称
ib0100
6-苄氨基喋呤（6-ba）
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
n8010
α-萘乙酸（naa）
摘要蚜虫是具破坏性的作物害虫之一，被蚜虫侵害的植物会释放挥发性化合物，以引起邻近植物的气传性免疫（ad）。本文揭示了mesa、sabp2、转录因子nac2和samt1形成了信号通路来介导邻近植物针对蚜虫和病毒的ad。空气中mesa能够被mesa受体蛋白水杨酸结合蛋白-2（sa-binding protein-2，sabp2）感知并转化为水杨酸（salicylic acid, sa）。水杨酸引起信号转导级联反应，sa激活转录因子nac2，上调水杨酸羧基甲基转移酶1（sa-carboxylmethyltransferase-1，samt1）基因的表达，激活nac2-samt1模块从而产生更多的mesa，诱导植物的抗蚜虫免疫，从而降低病毒的传播。一些蚜虫传播病毒比如黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒等能够编码含有解旋酶结构域的蛋白质，通过与nac2蛋白相互作用来抑制ad，改变nac2蛋白的亚细胞定位，促进nac2在细胞质中被26s蛋白酶体降解，从而负调控nac2-samt1通路，抑制mesa的合成和挥发，阻断植物间“预警通讯，促进蚜虫对邻近植物的侵染和对病毒的传播。本研究揭示了ad的分子机制和蚜虫-病毒共同进化的共生关系，表明ad是一种潜在的生物仿生策略，可以控制蚜虫和病毒的传播。
研究内容及结果
1. 验证植物抗病毒防御需要nac2作者通过免疫沉淀-质谱分析策略（ip-ms），成功鉴定了本氏猪笼草中黄瓜花叶病毒（cmv）的病毒发病机制过程中，核心蛋白cmv1a的相互作用蛋白组，并确定nac2为cmv1a的重要相互作用因子，以进行后续实验（扩展数据图1a）。cmv1a-nac2相互作用通过免疫共沉淀（co-ip）、双分子荧光（bifc）和荧光素酶互补成像（lci）试验进一步验证（扩展数据图1b-d）。为了评估nac2是否影响cmv对nac2.1/nac2.2双敲除（ko）突变株的感染，通过比较crispr-cas9基因编辑（扩展数据图2a）产生的突变株（nac2植株）和野生型（wt株）的感染结果，发现cmv感染导致nac2突变株的症状更严重，病毒rna和外壳蛋白（cp）的量更高（扩展数据图1e-g）。用gfp标记的马铃薯病毒y或gfp标记的tmv（tmv-gfp）感染的突变株和野生型植株中也有类似的结果（扩展数据图1h-m）。这些数据表明，nac2对植物抗病毒防御至关重要。
扩展数据图1
2. 证明nac2通过mesa介导ad对抗蚜虫
作者在研究中注意到，在nac2叶子上定植的绿桃蚜虫数量比在wt叶子上的数量多得多，进一步研究了nac2植株对蚜虫吸引力的作用。作者进行了圆形培养皿和y管嗅觉仪生物测定，发现nac2植株比wt植株吸引了更多的蚜虫，推测这可能是由空气传播信号介导的（扩展数据图1n-o）。作者使用气相色谱法与ms（gc-ms）相结合来鉴定蚜虫侵袭的wt植株与nac2植株释放的挥发物。而mesa是蚜虫侵袭wt植株与nac2植株产生差异的voc，并且蚜虫侵染后wt释放的mesa多于nac2植株（扩展数据图2e-h）。mesa是有据可查的可诱发蚜虫的voc10-13主要挥发物。为了测试nac2植株对蚜虫吸引力的影响是否归因于mesa的挥发，研究人员使用gc-ms测量了对蚜虫侵袭的wt植株在空气中mesa的排放率，发现每个蚜虫侵袭的wt植株mesa的排放率为34ng h−1（相当于每天排放0.816µg）（扩展数据图2f）。此外，研究人员发现，含有0.8µg mesa/羊毛脂处理的植株与蚜虫侵袭的wt植株有相似的mesa排放（扩展数据图2i，j）。因此，研究人员使用0.8µg mesa/羊毛脂涂抹对植株进行处理，结果表明nac2和wt植株对蚜虫表现出相似的吸引力（扩展数据图1p，q）。然而，当单独用羊毛脂或羊毛脂与其他挥发物（如3,3-二甲基己烷）处理时，nac2植株比wt植株对蚜虫更具吸引力（扩展数据图1r，s）。研究人员将nac2和wt植株置于挥发性mesa下24 h，然后通风2h，并比较了气态mesa如何影响植株对蚜虫的吸引力。在这样的条件下，wt植株对蚜虫的驱避性更强（扩展数据图1t，u）。然而，在通风和不进行挥发性mesa处理后，nac2植株之间的蚜虫驱避性没有明显差异（扩展数据图1v，w）。此外，与未进行mesa处理时观察到的情况一样，在mesa处理下，与挥发性mesa处理随后通风的wt植株相比，nac2植株对蚜虫的吸引力仍然更大（扩展数据图 1x，y）。
为了解释这种现象背后的原因（扩展数据图1t-y），研究人员用挥发性mesa处理nac2或wt植株24 h，然后通风，量化接收植株（接收器）排放的挥发性mesa。wt植株反而在空气中释放出更高水平的mesa（图1a，b）。随后研究人员比较了蚜虫mesa接收植株与模拟wt植株在涂抹后的吸引力，所有植株都含有mesa/羊毛脂，但发现它们在蚜虫偏好方面没有差异（图1c，d）。此外，在用mesa/羊毛脂涂抹nac2和wt接收植株后，这些mesa接收植株还同样吸引蚜虫（图1e，f）。接下来，研究人员以蚜虫侵袭的植物为发射植株（发生源），研究了nac2植株在自然露天环境下ad的作用（图3a）。在被吸汁蚜虫感染后，wt植株不断排放voc mesa（图1g，h）。值得注意的是，nac2接收植株释放的mesa波动性较低，但是当发生源受到蚜虫攻击时，与wt接收植株相比，其表现出对蚜虫更高的吸引力（图1i-l）。与邻近的模拟发射植株相比，受蚜虫侵染的wt相邻接收植株对蚜虫的驱避性更强，而与模拟蚜虫攻击发射植株相邻的nac2接收植株之间的蚜虫驱避性没有显著差异（图1m，n）。此外，在以接收植株喂食24小时后，wt中的蚜虫存活率降低，但nac2接收植株的存活率没有降低（图 1o，p）。这些结果表明，一旦感知到mesa，邻近接收植株中的mesa生物合成是以nac2依赖性方式调节进而介导可对抗蚜虫的ad。 扩展数据图2 图1
3.nac2激活samt1转录
接下来，研究人员开始探索nac2和mesa生物合成之间的分子遗传机制。nac2作为转录因子（扩展数据图3b），可以定位于细胞核中（扩展数据图3c）。随后，研究人员对有和没有蚜虫喂食的wt和nac2植株进行了rna测序（rna-seq）和比较转录组分析，并鉴定了许多潜在的nac2调节差异表达基因（扩展数据图4和补充表1和2），其中samt1的结果特别令人感兴趣（扩展数据图4e）。无论这些植物是否受到蚜虫的侵袭，nac2植株的samt1 rna水平都低于wt植株（补充表1和2）。samt1将sa转化为mesa19，研究人员通过定量研究nac2、ha-nac2过表达和wt植株叶片组织中的samt1转录本，以评估nac2是否通过调节samt1的转录表达。结果表明，与wt植株相比，nac2植株的samt1 mrna水平显著降低，但ha-nac2过表达植株的samt1 mrna水平升高（扩展数据图3d，e）。此外，荧光素酶报告基因实验表明，nac2增强了samt1启动子控制下的报告基因的转录（扩展数据图3f）。chip–qpcr、酵母单杂交和emsa分析均表明，nac2与samt1启动子结合，并激活报告基因转录（扩展数据图3g-i）。此外，nac2的瞬时过表达增加了植物mesa的产生（扩展数据图 3j）。这些结果表明，nac2-samt1模块与植物mesa生物合成的调控有关。
扩展数据图3 扩展数据图4
4. sa激活nac2-samt1模块引发ad
为了研究nac2是否通过激活samt1转录影响接收植株mesa的产生，研究人员评估了不同处理条件下突变株nac2、nahg和wt植株中的nac2和samt1的mrna水平（图 2f）。蚜虫侵袭后，wt和nac2植株的sa水平升高程度相近，然而，细胞mesa和samt表达的增加仅在wt植株中发现（图2e-g）。在wt接收植株和nac2接收植株邻近蚜虫侵袭植株中也发现了类似的结果（图 2h-j）。这些结果表明，nac2是蚜虫定向诱导或蚜虫介导的samt1表达和挥发性mesa产生所必需的。此外，外源性sa上调了nac2和samt1在wt植株中的表达，但在nac2突变株中samt1 mrna的表达水平未显著改变（图 2k，l）。与nac2突变株相比，外源性sa也诱导wt植株的mesa挥发性和蚜虫驱避性（图2m–p），并增加samt1-ko植株中nac2和samt1转录本的水平（图 2q；图2b，c），samt1植株对蚜虫的吸引力也更强，而且在samt1植株中外源性sa不诱导蚜虫驱避（图2r-t）。此外，暴露于蚜虫侵袭的samt1植株中挥发性mesa的产生减少（图3a，b），在进一步的蚜虫行为学实验中，研究人员发现与邻近模拟的wt接收植株相比，邻近蚜虫侵袭的wt发射植株的wt接收植株对蚜虫的驱避性更强，然而，无论何时将这些发射植株暴露于蚜虫侵袭中，与nac2或samt1发射植株相邻的wt接收植株在蚜虫驱避性方面都没有显著差异（图3c-e）。这些结果进一步证实了mesa作为植物ad中ppc信号的作用。总的来说，结果表明sa可以激活nac2-samt1转录进而增加发射和接收植株中挥发性mesa的产生。
作为一种sa结合蛋白，sabp2也可以与mesa结合，这对于细胞内mesa转化为sa至关重要。因此，sabp2可以作为一种obp样受体，感知并将发射植株产生的挥发状态mesa转化为sa以触发nac2介导的接收植株中的蚜虫抗性。为了验证这一想法，研究人员首先确认sabp2与sa结合（图3f），通过竞争结合实验验证mesa是否影响sabp2-sa的结合活性（图3g）。在无mesa的情况下，sabp2-[3h]sa（50 ci mmol−1）结合力为100%。然而，在相同的实验条件下，3nm和15nm的mesa，sabp2对[3h]sa的结合活性分别降低到约74%和46%（图3g）。因此，3nm的mesa足以满足用于[3h]sa与sabp2的竞争结合实验，表明mesa可以以生理浓度与sabp2结合。随后，研究人员建立了sabp2-ko突变株（sabp2），并测试了sabp2突变株与wt植株的蚜虫驱避性，用挥发性的mesa处理，然后进行通气，挥发性的mesa处理可增加wt的蚜虫驱避性和sa生物合成，但对于sabp2突变株并没有增加（图3h-j和扩展图2d）。此外，蚜虫喂食wt发射植株增加了wt植株的蚜虫驱避性，但sabp2未增加（图3k）。此外，外源性的sa对wt和sabp2植株的mesa挥发性无显著差异，表明sabp2对mesa的释放不是必须的（图3l，m）。这些结果表明，sabp2确实是一种obp样受体，可以感知并将空气中的mesa转化为sa，引起nac2介导的蚜虫驱避性。
samt1是植物抗病毒免疫所必需的。为了测试samt1是否为nac2介导的植物抗病毒免疫中的一个组成部分。研究人员敲低（kd）samt1植株中的nac2，使用基于烟草脆裂病毒（trv）诱导的基因沉默产生nac2/samt1双突变植株。与nac2突变株一样，nac2-kd植株表现出正常生长，和对cmv和pvy的高易感性（图1e-j，扩展数据图5a-e，h-l），表明病毒诱导的基因沉默nac2-kd与nac2-ko株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表现出相似程度的cmv或pvy易感性（图 5a-e，h-l）。此外，cmv感染增强了植物细胞内mesa水平（扩展数据图5f）。在病毒感染期间，nac2-kd、samt1和nac2/samt1植株的未侵袭叶片产生相似数量的mesa，但与wt植株相比，数量较低（扩展数据图5g）。此外，作者还研究了外源性mesa或sa在nac2、sabp2、samt1和wt不同植株中，mesa是否以及如何通过nac2介导植物抗病毒防御。与wt植株相比，nac2、samt1和sabp2植株对cmv和pvy更易感（图3n，o）。然而，外源性mesa可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但对sabp2植株无效（图 3n，o），可能是由于wt、nac2和samt1植株中的mesa转化为 sa。外喷sa也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（图3n，o）。这与以下事实一致：sa可以抑制多种病毒对植物的感染，包括cmv、马铃薯病毒x和tmv。
综上所述，mesa结合蛋白sabp2能够在结合mesa时，将细胞间的mesa转化成sa。由此实现信号的发起。随后sa激活nac2-samt1模块，以此上调内源mesa水平，促进nac2依赖性samt1的转录与翻译。
图2 图3 扩展数据图55. cmv1a破坏nac2的稳定性以抑制ad
研究表明cmv感染可以抑制蚜虫诱导的ad（图4a），从而有利于蚜虫的生存和病毒的传播与感染，可能是通过cmv介导mesa所致。cmv1a-nac2相互作用（扩展数据图1a-d）表明cmv1a可能参与cmv介导的ad抑制。为了验证这一点，首先生成了表达cmv1a的转基因烟草植物（扩展数据图6a，b），并评估了cmv1a对植物、蚜虫和ad吸引力的影响。圆形培养皿和y管嗅觉仪生物测定表明，cmv1a表达导致植物对蚜虫具有更高的吸引力（扩展数据图 6c，d）。表明cmv1a参与cmv介导的ad抑制。
为了了解 cmv1a-nac2相互作用在cmv介导的ad抑制中的重要性，研究人员鉴定了cmv1a中与nac2相互作用的关键氨基酸。cmv1a由n端甲基转移酶和c端atp依赖性解旋酶结构域（hd）组成。此外，研究人员发现cmv1a hd是cmv1a-nac2相互作用的主要区域（扩展数据图6l）。随后，研究人员使用alpha fold-multimer27模拟了cmv1a-nac2复合物的结构，并观察到 cmv1a中983位的甘氨酸残基与nac2物理距离最近，预测该残基可能是cmv1a与nac2相互作用所必需的（扩展数据图6m，n）。cmv1a hd或全长cmv1a中的g983d突变严重降低了cmv1a-nac2的相互作用（扩展数据图 6o-q）。
接下来，研究人员使用bifc研究了cmv1a-nac2相互作用的亚细胞定位，发现cmv1a在细胞核和细胞质中都与nac2相互作用（图1c），这与没有cmv1a共表达的nac2定位不同（图3c），表明cmv1a可以将一些nac2从细胞核转移到细胞质。类似的还有cmv1a–myc，但是cluc–myc和cmv1a（g983d）-myc均未出现这种现象，这或许可以解释引起部分rfp-nac2的细胞质定位和细胞核中较少的rfp荧光（扩展数据图 7a）。值得注意的是，cmv1a-myc没有改变rfp核定位，表明cmv1a-myc定向nac2的重新定位取决于nac2-cmv1a相互作用（扩展数据图7b）。此外，研究人员使用核输出信号（nes）标记的nac2研究了细胞质nac2的稳定性。结果发现nes-nac2定位于细胞质中，nac2易被26s-蛋白酶体系统降解（扩展数据图7c，d）。此外，瞬时cmv1a表达增强了26s-蛋白酶体系统对nac2的降解，但不影响rfp稳定性（扩展数据图 7e-i），而cmv1a（g983d）未引起nac2降解（扩展数据图7f–i）。
瞬时表达试验表明，是cmv1a而非cmv1a（g983d）抑制nac2介导的samt1激活启动子（扩展数据图7j）。此外，cmv1a（g983d）或cmv1a植株与wt植株的y管嗅觉仪生物测定和gc-ms分析表明，cmv1a（g983d）降低cmv1a介导的植物对蚜虫的吸引力和抑制mesa挥发（扩展数据图7k-m）。而且y管嗅觉仪生物测定提供了额外的证据，证实氨基酸残基gly983对cmv1a抑制植株间ad至关重要。
综上所述，表明cmv1a通过与nac2的直接相互作用，影响nac2的亚细胞定位并破坏其稳定性，从而降低转录因子nac2驱动的samt1激活和mesa的产生，进而干扰和抑制ad。
扩展数据图6 扩展数据图7 图46. 一些蚜虫传播的病毒抑制ad
cmv1a具有甲基转移酶和解旋酶活性，并构成病毒复制酶复合物的一部分，通过其hd与nac2相互作用（扩展数据图1a-d）。值得注意的是，来自许多蚜虫传播病毒的hds，包括马铃薯y病毒、黄蜂病毒、黄体病毒和阿尔法莫病毒在与cmv1a gly983相对应的位置均含有保守的甘氨酸残基（扩展数据图8和9a）。
gc-ms分析显示，pvy感染并影响了蚜虫侵染后植物mesa的挥发。此外，作者还研究了，两种蚜虫传播的病毒cmv和pvy使nac2能够从细胞核到细胞质重新定位（扩展数据图9i）。同样，pvy ci，而不是ci（g347d）或非蚜虫传播病毒tmv的126kd蛋白，与nac2相互作用（扩展数据图9j，k），并部分破坏nac2的稳定性（扩展数据图9l）。这些结果表明，一些蚜虫传播的病毒已经进化到利用含hd的蛋白质作为干扰植物ad的一般策略。 扩展数据图8 扩展数据图9
结论
本研究发现蚜虫侵染植物后，植物会产生mesa，诱导植物的抗蚜虫免疫，并降低病毒的传播。此外，还发现一些蚜虫传播病毒能够编码含有解旋酶结构域的蛋白质与nac2蛋白相互作用，改变nac2蛋白的亚细胞核定位至细胞质中，促使nac2在细胞质中被26s蛋白酶体降解，从而负调控nac2-samt1通路，抑制蚜虫侵染植物mesa的合成和挥发，阻断植物间“预警通讯，促进蚜虫对邻近植物的侵染和对病毒的传播。本研究也鉴定了识别和感知空气中mesa的气味结合蛋白（obp）样受体sabp2，揭示了mesa介导植物气传性免疫的分子机制及植物病毒的反防御机制，说明了一种全新的蚜虫-病毒之间共进化的共生关系，为voc触发ppc的详细机制奠定了基础，为未来植物与环境的适应性研究提供了方向。索莱宝产品亮点更多产品
套装货号
套装名称
描述
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
是体内能量储存和代谢的重要物质，为代谢提供能量，同时在细胞中作为辅酶发挥作用。
ia0590
三磷酸腺苷二钠
是用于代谢反应中底物活化的磷酸基团供体和大量激酶的辅酶。
ia2970
腺苷-5'-
单磷酸一水
是腺苷a1受体(adenosine a1 receptor)激动剂。
ib0100
6-苄氨基喋呤
(6-ba)
是一种细胞分裂素，通过刺激细胞分裂引起植物生长和发育，可调节植物的抗氧化系统的活性。
ie0110
24-
表油菜素内酯
是一种植物生长激素。据报道，具有缓解植物重金属和农药胁迫潜力。此外，在各种癌细胞中是一种潜在的凋亡诱导剂，而不影响非肿瘤细胞生长。
ih0650
28-
高油菜素内酯
是一种具有生物活性的化合物。
ih0660
28-
表高油菜素内酯
具有高促生长和抗应激活性的一类新型甾体植物激素。
in0540
1-萘乙酸(naa)
是具有生长素活性的合成植物生长调节剂。
ii0430
3-吲哚乙酸
是一种植物生长激素。可以添加到细胞培养基中用来诱导植物细胞伸长和分裂。
ii0500
吲哚丁酸
是植物生长素和良好的生根剂。它可以促进草本植物和木本观赏植物生根，并用于提高果实率。
ii0540
吲哚丙酸
是一种有效的神经保护性抗氧化剂和植物生长素。
ii0580
吲哚乙腈
是一种植物生长激素。