1、收集样品
2、相关试剂 总rna提取试剂trezol reagent (rna提取试剂), m-mlv(cdna逆转录酶), rna 纯化试剂, realqpcr mastermix (荧光定量pcr预混试剂)。
3、实验仪器 荧光定量pcr仪; pcr仪;低温离心机。
4、总rna提取
5、cdna合成 在0.5ml的离心管中加入1µl模板总rna(1µg/µl); 2µl随机引物(t18, 10pmol/ul);2µl 10mm dntp mix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性rna 5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6µl 5×pcr buffer;1µl rnaseout;1µl m-mlv rt;加水至30µl体系。pcr仪中反应条件设置 37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cdna置于 -20 ℃保存备用。
6、引物设计与thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7、实时定量pcr 按以下反应体系进行: 2x realqpcr mastermix(modified dna polymerase、sybr green i、optimized pcr buffer、5mm mgci2、dntp mix including dutp)25ul;上游引物f 1 ul，下游引物r 1 ul;cdna template 2ul。定量pcr仪扩增反应条件设置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40个循环)。
8、pcr产物溶解曲线分析 将所扩增的pcr 产物进行溶解曲线分析，单峰溶解曲线表示扩增产物单一，无非特异性扩增产物。溶解曲线生成的反应程序为: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
注意事项：收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定，对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融，标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月，-70度可保存6个月，部分标本需添加抑肽酶。