缺苞箭竹 ( fargesia denudata yi) 系禾本科箭竹属植物, 是川西亚高山针叶林下层最重要的优势种群 ( 齐泽民等, 2004) , 属于大熊猫的主食竹种之一 ( 刘兴良和向性明, 1994; 吴福忠等,2005) 。其生长周期为 50～60 年, 一次性开花结实后枯死 ( 秦自生等, 1996 ) , 这种生理特性会造成竹子在大面积开花时分布面积减小, 并对大熊猫的生存产生威胁 ( 吴福忠等, 2005 )。在这种情况下, 种子是竹子继续繁殖的重要途径, 因而对种子的活力及其老化的生理学研究也就成了人们关注的问题。人工老化通过提高种子所处环境的温度和湿度来加快种子老化的进程 (parrishand leopold, 1978; 田向荣等, 2003 ) , 使人们能在较短的时间内完成对种子老化的研究 ( 陈晓玲等, 2001) 。对不同大小种子的研究则可以帮助我们认识它们在活力等指标上的差异。已经证明多种植物种子在人工老化后种子活力、酶活性、丙二醛 (mda) 含量和电导率等指标会随之发生变化, 并且各指标间具有一定相关性 ( 胡家恕等, 1999; 唐 祖 君 和 宋 明, 1999; 陆 美 莲 等,2004) , 而不同大小种子在上述指标上也存在明显差异 (chiu 等, 2006 )。通过对这些指标的分析, 有助于探明种子的老化机理以及衡量种子活力。缺苞箭竹的种子十分难得, 尚未见到有对其进行人工老化研究的报道。本文通过研究人工老化与种子大小对种子活力和各个生理指标的影响, 探讨种子老化、大小和各指标之间的关系,为认识缺苞箭竹种子老化机理, 判断种子活力,并利用种子进行竹子繁育提供一定的理论基础。
一、材料与方法
试验于 2006 年 7 月～12 月在西华师范大学环境科学与生物多样性保护实验室中进行 , 试验材料采自四川片口自然保护区 , 采回后保存于 0～5℃环境中 , 平均发芽率为 36% 。
1.1 人工老化处理
将随机选取的种子分别放置在 45℃、50℃, rh100%条件下进行人工老化 , 具体做法参照文献中加速老化试验的设计 (parrish and leopold, 1978; 颜启传 , 2001) , 以恒温水浴箱为人工老化外箱 , 1 000 ml 烧杯为内箱 , 杯底部加水, 种子放置在杯内架子上与杯底水面保持 5～6 cm的距离保证种子不直接与水接触 , 烧杯与水浴箱分别加盖 , 调整好温度后分别处理 2、4、6 d。处理完后取出 ,在 25℃条件下干燥 48 h, 干燥前后分别称取种子的重量 ,计算种子的干湿重量比。对照种子在未经处理的种子中随机选取。
1.2 不同大小种子的分组
取 400 粒种子称其质量 , 最轻的 30% 为小种子 , 最重的 30% 为大种子 , 其余为中等大小种子 , 再次挑选大小种子时按同样的标准进行。百粒种子平均重量分别为 :大种子 1.42±0.018 g, 中等种子 1.16±0.014 g, 小种子0.77±0.034 g。平均水平的种子在未分大小的种子中随机选取 , 百粒重 1.10±0.013 g。经方差分析大、中、小种子重量差异显著。
1.3 不同指标的测定
种子发芽试验在人工气候箱 25℃环境中进行, 以培养皿为发芽容器 , 滤纸为发芽床 , 加蒸馏水保持湿度 ,每个样 25 粒种子 , 连续观察 60 天统计发芽数量并测量幼苗长度 (mm) 。
种子发芽指数 gi = ∑ (gt dt) , 活力指数 = gi×s,gt 为 t 日内的发芽粒数 , dt 为相应的发芽日数 , s 为观察结束时的幼苗长度 (mm) ( 颜启传 , 2001)。电导率测定 : 取 50 粒种子称重后用蒸馏水清洗干净 , 置于 250 ml 烧杯中加 125 ml 蒸馏水 , 加盖 , 然后于40℃恒温水浴箱中连续浸泡 3 天 , 使用 dds-11a 型电导率仪测定种子浸提液电导率。
电导率 (μscm- 1g- 1) = 浸提液电导率 (μscm- 1) 种子质量 (g)超氧化物歧化酶 (sod) 、过氧化氢酶 (cat) 活力、总抗氧化能力 (t-aoc) , mda 和蛋白含量均用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定 , 测定方法依次分别为羟胺法、钼酸铵法、比色法、tba 法和考马斯亮兰法 , 采用 752 分光光度计测定吸光度 , 不同测定种子均取 1 g。所有测定重复 2～3 次。指标测定后利用 spss11.5软件对数据进行单因素方差分析 (one-way anova) 和相关性分析 (pearson correlation)。
二、结果
2.1 人工老化对各指标的影响老化处理后种子的干湿重量比分别为: 45℃2 d: 86% , 4 d: 78% , 6 d: 71% , 50℃ 2 d: 78% ,4 d: 77% , 6 d: 73% , 可见随老化处理时间的加长种子吸收的水分增加。其它指标的测定结果见表 1, 表中以字母表示差异程度, 相同字母表示数据间无 差异, 不同 字母表示差异 显著 ( p <0.01, 下同)。从表中可知随着处理时间的延长和温度的升高种子老化程度不断加深。活力指数随老化程度的加深而下降, 处理 1、6 d 和处理2、4、6 d 的种子已完全失去了萌发能力。
电导率值除 45℃, 6 d 外均随老化程度的加深而上升, 50℃不同处理时间的电导率值差异显著; sod 在 45℃条件下 2 d 时开始显著上升, 在50℃时有所下降, 但 6 d 时又有小幅度上升; 两种温度条件下的 mda 含量 2 d 时最低, 6 d 时达到最大, 总体呈现先下降后上升的趋势; sodmda 的变 化趋 势 与 mda 正好 相 反; t-aoc 在40℃条件下 4 d 时开始显著下降, 之后变化不显著, 而在 50℃条件下不同处理时间之间的 t-aoc值差异均显著, 随老化程度的加深下降明显; 试验测定出的 cat 活力较低, 在两种温度的老化处理下均在 2 d 时有所上升随后下降, 且各处理间差异显著。以上结果显示人工老化处理导致种子活力指数显著下降, 脂膜过氧化反应的产物mda 增加, 抗氧化体系活力下降, 老化程度越深对种子的破坏越大。
2.2 相关性分析
对人工老化后所得结果进行相关性分析后发现 (表 2 ) 电导率、mda 同老化时 间显著正 相关, t-aoc、cat、sod mda 和老化时间显著负相关, sod 变化和老化时间的相关性不显著。其中 t-aoc 和 mda 与老化时间的相关性分别达到0.83 和 - 0.87。种子活力和电导率、t-aoc 呈极显著相关, 与其它指标相关性不显著。各个指标之间, sod mda 和 mda 间相 关性 达 到显 著 水平, t-aoc 和 sod mda, t-aoc 与 电导 率的 相关性都达到了极显著水平。
2.3 种子大小对种子活力和各指标的影响
不同大小种子各指标测定结果见表 3。从结果可以看出中等大小种子的活力最大,小种子次之, 大种子最小, 大中小种子活力差异显著。平均和大、中种子在电导率、sod mda 两个指标上差异不显著, 小种子在这两个指标上则分别显著大于和小于前三者。mda 含量随种子大小的减小而增大, t-aoc 和各酶活性在不同大小种子间也具有一定差异。可见种子大小对于缺苞箭竹种子来说是与其活力等指标相关的因素。
三、讨论
人工老化处理后缺苞箭竹种子的活力下降明显, 有 3 个处理的种子完全失去萌发能力, 说明高温高湿对其有很大危害, 因此在保存中应避免这样的环境, 以免种子过早老化。
关于种子的老化机理, 一般认为脂膜过氧化是一个重要原因 ( 谷建田等, 1998; 胡家恕等,1999; 李鑫和王倩, 2005 )。当种子在老化过程中产生自由基和过氧化物等有害物质的速率超过了抗氧化系统对它们的清除速度时, 就会对膜脂,蛋白质和核酸产生破坏, 导致抗氧化能力和种子活力 降 低 ( 唐 祖 君 和 宋 明, 1999; chiu 等,2006) , 同时膜透性增大电导率上升 (parrish andleopold, 1978) 。自由基还会自身氧化形成 mda并不断积累 (陈鹏等, 2005 ) , mda 含量上升是脂质过氧化 反应 增加的 标志 (jiang 等, 2001 )。本实验得出电导率和 mda 含量随老化程度的加深而上升并与老化程度正相关。根据以上理论这正说明了缺苞箭竹种子在老化过程中由于脂膜过氧化作用加剧而遭到破坏, 膜透性增大。
t-aoc 代表了机体防御体系抗氧化能力的强弱。对紫雏菊 ( echinacea purpurea) 的研究发现t-aoc 随老化程度的加深而下降, 并与种子的活力有很好的相关性 (chiu 等, 2006 )。与上述研究结果相似, 缺苞箭竹种子在遭受老化侵害后t-aoc 明显下降, 50℃, 6 d 时的 t-aoc 值仅为未老化时的 25.1% , 充分说明种子抗氧化能力的减弱。t-aoc 与 mda 和电导率负相关, 并分别达到了显著和极显著水平, 反映了种子在老化过程中抗氧化能力下降和种子所受到的侵害不断加强之间的关系。由于 t-aoc 和种子活力、老化时间以及各个指标间良好的相关性, 因此可作为反映种子老化程度的指标。
sod 和 cat 分别是机体中清除氧自由基和过氧化氢的保护酶 (bailly 等, 2001; 蔡传杰等,2003)。在一些研究中 sod 和 cat 活性随老化程度的加深而下降 ( 谷建田等, 1998; 唐祖君和宋明, 1999 ) , 但在对高羊茅 ( festuca arundinacea)种子和早熟禾 ( poa pratensis l .) 的研究中发现,人工老化初期的轻微处理可以刺激 sod 的上升,这是防止遭受自由基侵害的一种反应 ( 浦心春等, 1998; jiang 等, 2001 )。在本研究中, 老化种子的抗氧化能力不断下降但 sod 和 cat 酶的活性都出现过上升的趋势, 这可能也是上述原因所导致。另外 sod 和 cat 只是种子抗氧化体系中的一个组成部分, 其活性大小与种子活力并没有直接的关系。sod 是本研究中唯一与老化时间不相关的指标, 其活力在更多不同老化处理条件下的变化还有待进一步研究。基于以上原因本文尝试使用 sod mda 来表示 sod 活力变化对种子抗氧化能力的影响, 所得结果与多个指标具有显著相关性, 其比值先上升后下降的变化趋势正好与mda 含量的变化相对应, 一方面可以作为 mda在 2 d 时较低的原因, 另一方面也说明种子的抗氧化能力最终是呈下降的趋势。
种子大小是 其质量的 一个重要 指标 (chiu等, 2006)。在对 红菜苔 ( brassica campesiris l .)( 李锡香和胡淼, 1995) , 玉米 ( zea mays l .) ( 石海春等, 2005) , 紫雏菊 (chiu 等, 2006) 种子的研究中发现种子的大小与活力相关, 紫雏菊种子mda 含量随种子的增大而减小, 而总抗氧化能力以及酶的活性则呈现相反的变化趋势。在本研究中, mda 含量、总抗氧化能力和酶活力的变化与上述研究相同。但在上述研究中种子活力均是大种子大于小种子, 这是因为小种子的饱满度低, 营养提供不充分 ( chiu 等, 2006 )。产生这种差异的原因除品种间可能具有差异外主要是对活力计算方法的不同。在上述对玉米和红菜苔的研究中种子的活力用发芽率和幼苗长度或重量的乘积表示, 而在本研究中则用发芽指数和幼苗长度的乘积表示。缺苞箭竹大种子的发芽率与中小种子相比并无明显差异, 是由于其发芽所需的时间较长而造成得出的活力值较低。同时大种子的酶活性高而活力较低也说明了种子活性是与酶活性和营养物质等提供程度等众多因素相关的复杂过程。
从以上的结论可以看出, 高温高湿条件会对缺苞箭竹种子的活力产生严重影响, 加速了种子的老化。脂质过氧化是其老化的重要原因, 它导致种子电导率和 mda 含量上升, 抗氧化能力下降。t-aoc 和 sod mda 能够很好的反映出缺苞箭竹种子的活力、老化的程度和抗氧化能力的变化。缺苞箭竹种子的大小是与活力和酶活性等指标相关的重要因素, 中等种子的活力大于大、小种子。不同大小种子抗老化能力的差异还有待进一步研究。