摘要:合成或人工色素在食品和饮料中作为添加剂，可以改善产品的外观。在本研究中，我们开发了一种稳定的反相液相色谱 (rp-hplc) 方法，实现了 10 种合成色素的同时测定。采用配有 agilent poroshell ec-c18 色谱柱的 agilent 1260 infinity 液相色谱系统实现分离和定量分析。通过部分验证确定了方法的稳定性。通过分析糖果中的色素添加剂，证明了该方法定量分析食品基质中人工色素的适用性。将 hplc 方法有效转换为一个耗时短的超高压液相色谱 (uhplc) 方法，采用 agilent 1290 infinity 液相色谱系统，实现更快速的分析，且不损失分离度。采用 agilent 1290 infinity 二管阵列检测器 (dad)，可以选择不同的波长，实现在不同色素各自的大吸收波长处进行定量测定。采用两种方法，分别确定了每种色素的检测限 (lod)、定量限 (loq)、精密度、准确度和线性。在分析工作流程中采用 agilent 7696a 样品制备工作台，帮助在lod、loq 和线性研究中进行样品处理。
言色素添加剂是指加入食品中使其带颜色的任何染料、色素或物质1。当有主要来源于植物或动物的天然和合成色素添加剂。如：姜黄和藏红花。合成色素是化学合成的色素，如酒石黄和靛胭脂2。在食品中加入色素有许多原因。其中包括补偿因储存出现的褪色、纠正颜色的自然变化，以及使无色食品着色等。实际上，色素添加剂是市场上大多数包装食品不可避免的一类成分1。研究业已证明，人工色素暴露量超出每日摄入*将会导致儿童产生多动症和其他不安行为3。美国食品药品监督管理局 (fda) 已经制定了相关条例，旨在控制和确保食品中仅含有允许使用的色素添加剂。这就强调了使用分析技术对色素进行鉴别和定量分析的重要性。在本文中，我们采用 agilent poroshell120 ec-c18 色谱柱，开发了一个反相高压液相色谱方法。食品色素的水溶性使反相 hplc 成为分析这些物质的理想技术。
方法仪器与软件agilent 1260 infinity 四元液相色谱系统包括如下模块：• agilent 1260 infinity 四元泵和真空脱气机 (g1311b)• agilent 1260 infinity 自动进样器(g1367e)• agilent 1260 infinity 柱温箱 (g1316a)• 带大光强流通池（60 mm 光程）(g4212-60007) 的 agilent 1260infinity 二管阵列检测器 (g4212b)• agilent poroshell 120 ec-c18 色谱柱，4.6 x 150 mm，2.7 µm (693975 902)开发和运行 uhplc 分析所使用的 agilent1290 infinity 液相色谱系统包括：• 集成了真空脱气机 (g4220a) 和 100 µljet weaver 混合器的 agilent 1290infinity 二元泵• agilent 1290 infinity 自动进样器(g4226a)• agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c)• 带大光强流通池（1.0 µl 扩散体积，10 mm 光程）(g4212-60008) 的 agilent1290 infinity 二管阵列检测器 (g4212a)• agilent poroshell 120 ec-c18 色谱柱，内径 2.1 mm，柱长 75 mm，采用 2.7 µm颗粒填充 (697775-902)两套系统均采用安捷伦化学工作站（b.04.02 版）进行控制。系列线性浓度稀释样品采用 agilent 7696a样品制备工作台制备。
试剂与材料所有化学品和溶剂均为 hplc ，高纯水使用 milli q 水纯化系统（millipore elix10 型，美国）制备。甲醇为超梯度，购自 lab-scan 公司（泰国曼谷）。磷酸氢er钠和正磷酸购自 fluka 公司（德国）。二甲基亚砜 (dmso) 购自 qualigens 公司（印度）。酒石黄、苋菜红、靛胭脂、胭脂红 4r、日落黄 fcf、红色酸性染料、固绿 fcf、酸性蓝/亮蓝、胭脂红 3r，以及赤藓红 b 标准品购自 aldrich 公司（印度）。用于回收率和定量分析的糖果购自本地。
色谱参数反相液相色谱和 uhplc 中使用的色谱参数见表 1。
色素标准溶液称取各标准品约 20 mg，分置于 10 ml 容量瓶中，分别制备酒石黄、苋菜红、靛胭脂、胭脂红 4r、日落黄 fcf、红色酸性染料、固绿 fcf、酸性蓝/亮蓝、胭脂红 3r，以及赤藓红 b 的标准储备液。于每个容量瓶中加入 300 µl dmso，将流动相 a 和 b 按照 80:20 的比例预混合的溶液作为稀释剂。需要时超声处理。混合标准溶液和线性浓度取各标准溶液约 100 µl 并混合，加入稀释剂至 2000 µl，得到每种色素浓度均为 200 ppm 的色素标准混合溶液。使用 agilent 7696a 样品制备工作台连续稀释该 200 ppm 标准混合溶液，制备系列线性浓度的标准溶液。线性标准溶液的浓度范围为 0.01 ng/µl – 200 ng/µl（10 个浓度水平及各重复 6 次）。
用于色素定量分析和回收率研究的样品处理使用不同类型的样品（即包含不同色素的糖果）进行色素定量分析和回收率研究。依次向 2 g 糖果中加入 400 µl dmso 和20 ml 稀释剂，提取其中的色素，过程非常简单。超声处理并采用带有 c0650转子的 beckman coulter allegra x22r 离心系统，以 8300 rcf 的离心力离心 10 min后，溶液通过 0.25 µm ptfe agilenteconofilter 注射式过滤器滤膜过滤，滤液待分析。使用加标和不加标的糖果样品进行回收率研究。样品加标采用柱上浓度为 25 ng 的标准混合溶液。提取过程如所述。
预防措施为了延长化合物在溶液中的稳定性，不使用时，所有制备的溶液用铝箔包裹，并于冰箱暗处 4 °c 贮存。分析期间，可恒温的自动进样器样品盘保持在 5 °c。步骤表 2 所示的系列浓度校准溶液是采用稀释剂系列稀释 200 ng/µl 标准混合溶液而得。在两个系列溶液的配制中，采用带500 µl 注射器的 agilent 7696a 样品制备工作台来配制线性浓度的溶液。在第yi序列，向每个样品瓶中加入一定量的稀释剂；在第二序列，将 250 µl 200 ng/µl的溶液加入样品瓶并涡旋 15 s。注意,除了分别运行这两个序列外，这些步骤也可以在一个方法中编程并在一个序列中运行。取上一个浓度的溶液 250/100 µl置于下一个浓度的样品瓶中进行系列稀释。agilent 7696a 样品制备工作台设置的注射器参数见表 3。agilent 7696a 样品制备工作台4 的设置在安捷伦应用简报（出版号 5990 6850chcn）中有详细描述。进样分析 5 µl 含有 dmso 的稀释液作为空白，然后依次进样分析系列浓度的各校准溶液，每个浓度平行分析 6 次。用每个浓度的峰面积和保留时间 (rt) 数据来计算标准偏差 (sd) 和相对标准偏差 (rsd)值。并以较低线性浓度溶液的进样分析确定 lod 和 loq。以各色素每个线性浓度峰面积的平均值对其相应浓度作图，构建线性曲线。
通过改变 6 个关键的方法参数来评估方法的稳定性。平行 6 次进样分析含每种色素各约 30 ng（柱上量）的标准混合溶液，利用获得的数据来研究方法的稳定性。分别进样分析 2 g 糖果中加标 25 ng 色素添加剂标准品和不加标的样品溶液，来研究方法的回收率。利用所有 10 种色素标准品的特征图谱建立其 uv 谱库。连同保留时间，该谱库可用来鉴定糖果中的色素添加剂。该方法可有效转换到 uhplc。评价了每种色素的 lod、loq 和线性，方法精密度通过峰面积和 rt 的 rsd 来确定。同时还绘制了所有色素使用 uhplc 方法的线性曲线。uhplc 方法可使分析更快速，并且不损失分离度
结果与讨论分离与检测采用 agilent poroshell 120 ec-c18（150 mm x 4.6 mm，2.7 µm）色谱柱，这 10 种色素在 20 min 内实现了良好分离。不同的色素具有不同的大吸收波长。这 10 种色素的色谱流出曲线见图 1，色素列表及其各自的大吸收波长见表 4。我们使用化学工作站软件中的峰纯度功能检查各色谱峰的纯度，从而评价了方法的属性。通过对精密度、线性范围、准确度、属性、回收率和稳定性进行研究来验证本方法。
检测限 (lod) 与定量限 (loq)信噪比 (s/n) > 3 时的分析物浓度定义为lod，s/n > 10 时的分析物浓度定义为loq。测得的每种色素的 lod 和 loq 值见表 5。作为一个实例，图 2 展示了胭脂红 4r loq 浓度（柱上量 0.1 ng）时与空白的叠加色谱图。
线性所有制备的线性浓度溶液平行进样分析6 次，利用峰面积响应及其相应的浓度值来构建每种色素从 loq 浓度到高浓度的线性曲线。获得的所有色素的相关系数
关键词：色谱柱 工作台 脱气机 柱温箱