中华人民共和国国家标准
gb 31656.16-2022
食品安全国家标准
水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定
气相色谱法
national food safety standard-
determination of chloramphenicol，thiamphenicol，florfenicoland and
florfenicol-amine residues in aquatic products by gas chromatography
1范围
本文件规定了水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量测定的制样和气相色谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾、鳖、贝、海参等水产品可食组织中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺，在碱性条件下用乙酸乙酯提取，正己烷去脂，固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生化，气相色谱法检测，外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
5.1.4乙酸（ch3cooh）：色谱纯。
5.1.5乙酸乙酯（c4h8o2）：色谱纯。
5.1.6甲苯（c7h8）：色谱纯。
5.1.7浓氨水（nh3·h2o）。
5.1.8 n，o-双（三甲基硅烷基）三氟（fu）乙酰胺（bstfa）：c8h18f3nosi2。
5.1.9三甲基氯硅烷（tmcs）：c3h9clsi。
5.2溶液配制
5.2.1乙酸乙酯-氨水：取浓氨水2 ml，用乙酸乙酯稀释至100 ml。现用现配。
5.2.2甲醇-氨水：取浓氨水2 ml，用甲醇稀释至100 ml。现用现配。
5.2.3 5%乙酸溶液：取乙酸5 ml，用水稀释至100 ml。
5.2.4衍生化试剂：取n，o双（三甲基硅烷基）三氟（fu）乙酰胺（bstfa）与三甲基氯硅烷（tmcs），按体积比99：1混合。现用现配。
5.3标准品
氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺，含量均≥98%。具体见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液：取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准品各15mg，精密称定，分别加乙腈适量使溶解并稀释定容至100ml棕色容量瓶，配制成浓度均为150μg/ml的标准储备液。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.2混合标准工作液：分别准确量取氯霉素标准储备液1ml，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺各10ml于50ml容量瓶，用乙腈稀释至刻度，制成氯霉素浓度为3μg/ml，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺浓度均为30μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期1个月。
5.5材料
5.5.1mcx固相萃取柱：60mg/3ml，或相当者。
5.5.2移液器：20μl~200μl，200μl~1 000μl。
5.5.3鸡心瓶：100 ml。
5.5.4聚乙烯离心管：15 ml、50 ml，具塞。
5.5.5玻璃离心管：10 ml，具塞。
5.5.6棕色反应瓶：规格2 ml。
6仪器和设备
6.1气相色谱仪，配63ni电子捕获检测器。
6.2均质机。
6.3旋转蒸发仪。
6.4离心机。
6.5涡旋混合器。
6.6分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.7氮吹仪。
6.8超声波清洗器。
6.9固相萃取装置。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
按gb/t 30891-2014附录b的要求制样。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
取试料5g（准确至±0.05g），置50ml具塞玻璃离心管中，加乙酸乙酯氨水20ml，立即涡旋1 min，超声15 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于100 ml鸡心瓶中，重复提取1次，合并上清液，加入5%乙酸溶液3 ml，振荡混匀，40℃旋转蒸发至约1.5 ml，备用。
8.2净化
取备用液于10 ml离心管，用5%乙酸1. 5 ml洗涤鸡心瓶，洗液并于离心管。加正己烷5 ml，涡旋混合1 min，4 000 r/min离心5min，取水层，用正己烷5 ml重复脱脂1次，取水层，备用。
取mcx固相萃取柱，依次用甲醇3ml、水3ml.活化，取经正己烷脱脂后的备用液，过柱，用5%乙酸溶液2ml淋洗，弃去淋洗液，用甲醇氨水6ml洗脱，收集洗脱液，65℃氮气吹至近干，再依次用甲醇1 ml乙酸乙酯1 ml洗涤离心管壁，氮气吹至近干，备用。
8.3衍生
8.3. 1试料的衍生化
取吹干的提取物，加乙腈100μl复溶，移至2 ml棕色反应瓶中，再用100μl清洗并合并至棕色反应瓶中，加行生化试剂100μl，盖塞并涡旋混合10s，60℃烘箱中反应30 min。冷却至室温，50℃~55℃氮气吹干，准确加入甲苯1.0 ml，涡旋混匀，供气相色谱仪测定。
8.3.2标准工作液的衍生化
取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准工作液适量于2ml棕色反应瓶中，置50℃氮吹仪吹干。以下按8.3.1的步骤操作。
8.4标准曲线的制备
分别精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准工作液适量，用乙腈稀释氯霉素浓度为1.0μg/l、1.5μg/l、5.0μg/l、15.0μg/l、50.0μg/l、150.0μg/l，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度均为10.0μg/l、15.0μg/l、50.0μg/l、150.0μg/l、500.0μg/l、1500.0μg/l的系列标准溶液，经衍生化后，供气相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.5测定
8.5.1色谱条件
a）色谱柱：db-5ms石英毛细管柱（30 m×0.25mm，膜厚0. 25μm），或相当者；
b）进样方式：不分流进样；
c）载气：氮气，纯度99.999%；
d）柱流速：1.0 mll/min，尾吹为25ml/min；
e）进样口温度230℃，检测器温度310℃；
f）柱温程序：起始80℃保持1 min，以30℃/min升温至280℃，保持5 min；
g）进样量：1.0μl。
8.5.2测定法
取试料溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试料溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液气相色谱图见附录b。
8.5.3空白试验
取空白试样，除不加药物外，采用完（wan）全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测物的残留量，按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中待测物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准溶液中待测物浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
a——试样溶液中待测物色谱峰面积；
as——标准溶液中待测物色谱峰面积；
v——试样溶液最终定容体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法氯霉索的检测限为0.1μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的检测限均为1.0μg/kg。氯霉素的定量限为0.3μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的定量限均为3.0μg/kg。
10.2准确度
本方法氯霉素在0.3μg/ kg~30.0μg/kg添加水平上的回收率70%~120%；甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在3.0μg/hg~ 300μg/kg添加水平上的回收率灼为70%~120%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。