正常人的血清*水平正常为9.9ng / ml。在身体异常或得病时，*水平会显著变化。*干酪培养基采用干酪乳杆菌（atcc 7469）为测定用菌，用于*的微生物法测定。该培养基是基于flynn等人(1)的配方，并经baker等人(2)和waters、mollin(3)改良。用于维生素测定的测定菌通常需要三种培养基：维持培养基、接种培养基和测定用培养基。后者通常是化学限定的培养基，包含所有测定菌生长所需的养分，但不含有待测的分子。类似的，*干酪培养基包含干酪乳杆菌生长所需的所有成分，但不包含*。因而，添加一系列浓度增加的*，会观察到干酪乳杆菌生长反应的递增。
干酪乳杆菌（atcc 7469）的贮备菌制备是在aoac*的乳杆菌琼脂（货号m366）试管穿刺接种培养，35-37°c孵育18-24小时后，试管储存在冰箱里。每月转接一次。测定菌液的制备是将贮备菌转种到含10ml微量维生素检测接种肉汤（货号m133）或乳酸杆菌肉汤（货号m367）的试管中。35-37°c孵育24小时后，在无菌条件下菌液离心，弃掉上清，再重悬于10ml的无菌*干酪培养基中（货号m543）。再像之前一样沉淀，并清洗一次。zui后，清洗后的菌株重悬于10ml*干酪培养基中，并用该培养基进行1:100稀释。1滴重悬液用于接种到每个测定管中。也可用0.85% nacl代替培养基来清洗和稀释。
由于灭菌条件，孵育温度等因素会影响标准曲线读数，并且每次不会*一样，因此每次都应制备标准曲线。10ml管内的标准品量为0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。
*标准品的制备：将20mg*干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸馏水中。用0.1n naoh调整溶液ph值为10.0，再用0.05n hcl调ph为 7.0。该溶液含有200g*/ml。用999ml蒸馏水稀释1ml该溶液，则浓度为200ng/ml。再用999ml*缓冲液a（货号m544）稀释1ml该溶液，则为0.2ng/ml的*标准溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml该溶液，配置即告完成。
血清样本的保存：让血液样本凝固以分离血清。分离血清至干净干燥的血清管，并离心除去存在的任何血细胞。小心操作，避免出现红细胞的溶血。分装血清样本至于干净干燥的试管中，每管5ml。每管加入25mg的抗坏血酸。-20°c以下温度保存。
血清样本的制备：解冻含有抗坏血酸的血清。向5ml样品中加入45ml*缓冲液a（m544）。孵育37℃90分钟。然后15磅121℃高压灭菌2.5分钟。离心去除凝固的蛋白，将上清液转移至清洁干燥的管中。该透明溶液即可用作*待测的样本。
样本*浓度的测定步骤：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他体积的制备好的血清提取物。加入5ml*干酪培养基和足量的蒸馏水，使每个试管的总体积为10ml。15磅121°c灭菌5分钟。冷却试管并向每个试管中加入一滴接种液。35-37℃孵育18-24小时后进行浊度读数。读数前将试管冷藏15-30分钟以停止细菌生长。620nm检测吸光度。待测样品中的*含量应根据标准曲线来确定，不过要考虑样品稀释度。
应非常小心，避免培养基和玻璃器具被污染。应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。少量的外源物质的污染可能导致错误的结果。